8分文章實例告訴你lncRNA在鐵死亡和癌癥中該怎么研究
LncRNAs功能眾多，也是目前大家的研究熱點。而鐵死亡（ferroptosis）這一新研究內(nèi)容正在悄悄興起，或成為下一次基金申請中的熱門內(nèi)容之一。目前認(rèn)為，鐵死亡是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物的代謝障礙，進(jìn)而在鐵離子的催化下異常代謝，產(chǎn)生大量脂質(zhì)，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，攻擊生物大分子，觸發(fā)細(xì)胞的死亡。在鐵死亡研究尚存在眾多謎團(tuán)的情況下，關(guān)于lncRNAs在鐵死亡中的作用研究更是少之又少。下面便給大家分享其中的一篇關(guān)于肺癌的研究。
文章流程圖
在前文研究中，作者團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)Lymphoid-Specific Helicase （LSH）能與WDR76相互作用并促進(jìn)如GLUT1、SCD1和FADS2等一系列鐵死亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制鐵死亡過程和促進(jìn)肺癌的發(fā)生。在本文中，作者首先提出在LSH調(diào)節(jié)鐵死亡過程中是否存在lncRNA參與這一問題。作者在LSH過表達(dá)后RNA-seq結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了22個差異表達(dá)的lncRNA并在H358細(xì)胞中通過qPCR驗證了測序結(jié)果，之后將研究目標(biāo)鎖定在表達(dá)量上升最高的LINC00336上。與之相對的，敲低LSH之后LINC00336的表達(dá)也顯著下降。在肺癌臨床樣品中，LINC00336表達(dá)量也顯著高于正常組織。結(jié)果如圖1所示。
圖1 LINC00336表達(dá)受LSH調(diào)節(jié)并且與肺癌預(yù)后相關(guān)
接下來作者檢測了LINC00336調(diào)控肺癌細(xì)胞的各種表型。LINC00336過表達(dá)之后，肺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和成瘤能力都顯著上升，而鐵死亡水平顯著降低。不同作用機(jī)制的鐵死亡激活劑erastin和RSL3處理后，過表達(dá)LINC00336都能顯著上調(diào)細(xì)胞存活。作者檢測了總鐵含量、二價鐵離子含量、膜脂活性氧自由基、線粒體超氧化物和線粒體膜電位一系列鐵死亡標(biāo)志表型驗證了這一結(jié)果。結(jié)果如圖2所示。敲低LINC00336之后的結(jié)果相反，如圖3所示。
圖2、圖3 LINC00336促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、克隆形成和成瘤能力并抑制鐵死亡
圖4 LINC00336與ELAVL1存在相互作用
LINC00336如何發(fā)揮調(diào)控鐵死亡的功能呢？作者首先檢測發(fā)現(xiàn)LINC00336定位于細(xì)胞核中。于是進(jìn)一步通過RNA pulldown分析檢測了與LINC00336相互作用的蛋白質(zhì)。通過反義RNA對照和兩種細(xì)胞H358和PC9的重復(fù)，作者發(fā)現(xiàn)并驗證了ELAV-like RNA-binding protein 1 (ELAVL1)與LINC00336的相互作用。使用ELAVL1抗體進(jìn)行RIP實驗也有同樣的結(jié)果。ELAVL1具有結(jié)合RNA并使其更穩(wěn)定的功能，它識別無m6A甲基化的RNA并且結(jié)合基序為poly-U或AU-rich。在進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測和結(jié)構(gòu)域分析之后，作者對LINC00336和ELAVL1進(jìn)行了一系列的截短檢測，最后得出結(jié)論：ELAVL1的101-213氨基酸和LINC00336的1901-2107核苷酸相互作用。結(jié)果如圖4所示。
圖5 ELAVL1促進(jìn)LINC00336的穩(wěn)定
在過表達(dá)ELAVL1之后，LINC00336 RNA水平上升，敲低結(jié)果相反。放線菌D處理后，過表達(dá)ELAVL1使LINC00336降解更慢；敲低結(jié)果則相反。結(jié)合上述結(jié)果，這證明了ELAVL1結(jié)合并穩(wěn)定LINC00336。此外，作者也發(fā)現(xiàn)ELAVL1也在LSH過表達(dá)后表達(dá)量上調(diào)。P53也被報道在鐵死亡中發(fā)揮著調(diào)控作用。一般認(rèn)為，野生型P53正向調(diào)節(jié)鐵死亡。該作者在之前的研究中也發(fā)現(xiàn)了LSH-lncRNA P53RRA-P53之間的調(diào)節(jié)作用。因此，作者也檢測了P53在這個過程中的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果如圖5所示。
圖6 LINC00336結(jié)合MIR6852進(jìn)而調(diào)控CBS mRNA水平
LncRNA發(fā)揮功能的方式很多?？梢酝ㄟ^形成特殊結(jié)構(gòu)結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子并激活或者抑制其轉(zhuǎn)錄活性；可以通過其特異堿基序列引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子激活特定基因的轉(zhuǎn)錄；可以直接影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的高級結(jié)構(gòu)；可以直接也mRNA結(jié)合發(fā)揮激活或抑制功能；也可以結(jié)合miRNA發(fā)揮sponge作用。雖然作者檢測了LINC00336這一細(xì)胞核lncRNA的相互作用蛋白，但只研究了對其有穩(wěn)定作用的ELAVL1，對LINC00336在鐵死亡中的功能仍未解釋完全。于是，作者從sponge作用的角度對LINC00336進(jìn)行了分析。在miRPathDB Microinspector分析結(jié)果中，作者發(fā)現(xiàn)了MIR6852能直接結(jié)合LINC00336和cystathionine-β-synthase(CBS)；而CBS是鐵死亡過程中硫轉(zhuǎn)運通路活性的標(biāo)志蛋白。CBS的高表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)的鐵死亡水平。進(jìn)一步的過表達(dá)、敲低和雙熒光素報告基因系統(tǒng)的研究證明了LINC00336通過ceRNA機(jī)制吸附MIR6852從而促進(jìn)CBS的表達(dá)。結(jié)果如圖6所示。
本篇文章lncRNA研究思路經(jīng)典，鐵死亡相關(guān)檢測也具有系統(tǒng)性，值得大家參考學(xué)習(xí)。此外小編仍對LSH過表達(dá)后ELAVL1啟動子區(qū)域P53結(jié)合下降但其mRNA水平升高以及LINC00336相互作用蛋白中是否有其他的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白充滿疑問。歡迎大家解答。