H19-乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)

對于激素受體陽性的乳腺癌來說，它莫西芬的耐藥性仍然是一個(gè)臨床挑戰(zhàn)。近年來，自噬失調(diào)被認(rèn)為是它莫西芬耐藥的潛在機(jī)制。雖然lncRNA H19參與腫瘤發(fā)生的各個(gè)階段，但其在它莫西芬耐藥性中的作用仍不清楚。為了了解H19在抗它莫西芬乳腺癌發(fā)展中的作用，今天小編給大家介紹近期發(fā)表的一篇文章。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析了H19在它莫西芬耐藥乳腺癌組織中的表達(dá)。H19基因的下調(diào)被用來評估體內(nèi)外對它莫西芬的敏感性。還通過H19的表達(dá)下調(diào)和過表達(dá)來分析自噬的狀態(tài)。并采用實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)、染色質(zhì)免疫沉淀、免疫熒光、Western blot等方法研究H19對它莫西芬的耐藥機(jī)制。
結(jié)果：
1）自噬促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞系對它莫西芬的耐藥性
為了探討自噬在它莫西芬耐藥性過程中的作用，我們建立了抗它莫西芬MCF7細(xì)胞系（MCF7 /TAMR）。為了確認(rèn)該細(xì)胞系的建立，我們進(jìn)行了單層菌落形成實(shí)驗(yàn)（圖1a）。14天后，用5或10μM它莫西芬處理后，親代MCF7細(xì)胞存活率明顯下降，而MCF7 / TAMR細(xì)胞不受它莫西芬的影響。為了研究自噬是否對它莫西芬耐藥有影響，我們使用細(xì)胞樣自噬檢測方法分析了兩種細(xì)胞系的自噬液泡，發(fā)現(xiàn)MCF7/TAMR細(xì)胞比MCF7細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光信號，這表明自噬增加（圖1b）。此外，Western blot結(jié)果顯示，由于LC3-II表達(dá)增加，MCF7/TAMR細(xì)胞誘導(dǎo)自噬能力強(qiáng)于MCF7細(xì)胞（圖1c）。另外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證自噬在它莫西芬耐藥中的作用，我們使用了兩種自噬抑制劑3-MA和CQ。用 5mM 3-MA或5μM CQ 處理14天后，細(xì)胞MCF7 / TAMR對它莫西芬的抗性減少（圖1d，e）。為了排除增殖減少是否受凋亡影響，我們還比較了這些組的凋亡水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在對照、它莫西芬、3-MA、CQ或它莫西芬聯(lián)合兩種自噬抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的MCF7/TAMR細(xì)胞凋亡水平相似（圖1d，f）。這些數(shù)據(jù)表明自噬促進(jìn)了MCF7/TAMR細(xì)胞對它莫西芬的耐藥性。

2）H19在抗它莫西芬的乳腺癌細(xì)胞系和腫瘤組織中上調(diào)，并促進(jìn)對它莫西芬的耐藥性

我們分析了37例乳腺癌的臨床組織，包括14例它莫西芬敏感樣本和23例它莫西芬耐藥樣本。與它莫西芬敏感組相比，H19在它莫西芬耐藥組的過表達(dá)更為頻繁（圖2a）。我們進(jìn)一步測量了MCF7/TAMR和親本MCF7細(xì)胞株中H19的水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，H19在MCF7/TAMR細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于親本MCF7細(xì)胞（圖2b）。同樣 GSE26459和GSE28645數(shù)據(jù)集均表明，與它莫西芬敏感的MCF7細(xì)胞組相比，它莫西芬耐藥細(xì)胞組H19表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖2c）。為了確定H19在它莫西芬耐藥中的作用，我們通過shRNAs沉默H19。qRT-PCR證實(shí)，與MCF7/ TAMR對照細(xì)胞相比，MCF7/TAMR-shH19細(xì)胞的RNA表達(dá)水平至少降低了80%（圖2d）。然后，我們用單層菌落形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)評估了它莫西芬的敏感性。單層細(xì)胞集落形成試驗(yàn)證實(shí)MCF7 / TAMR-shH19細(xì)胞形成的菌落更少（圖2e）。另外，在MCF7/TAMR細(xì)胞中使用兩個(gè)獨(dú)立的siH19獲得了相似的細(xì)胞存活率結(jié)果（圖2f，g）。有趣的是，我們還產(chǎn)生了穩(wěn)定的過表達(dá)H19的MCF7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H19在野生型MCF7中過表達(dá)可以概括它莫西芬的耐藥性（圖2h，i）。最后，為了研究H19對細(xì)胞周期進(jìn)展的影響，我們采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。細(xì)胞周期分析顯示，H19的缺失在G2/M期誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯（圖2j）。
3）H19在它莫西芬耐藥乳腺癌中促進(jìn)自噬活性

為了確定H19與自噬的關(guān)系，我們進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，H19的下調(diào)降低了MCF7/ TAMR細(xì)胞自噬體的熒光信號（圖3a）。為了確定H19的抑制是否影響MCF7/TAMR細(xì)胞的自噬通量，我們使用自噬蛋白LC3-II和溶酶體抑制劑CQ進(jìn)行分析。從CQ存在下LC3-II水平升高可以看出，與對照組相比，H19沉默組自噬通量下降，說明H19的下調(diào)抑制了自噬合成（圖3b）。然后，我們使用穩(wěn)定的過表達(dá)MCF7/TAMR的H19細(xì)胞株進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。H19的表達(dá)促進(jìn)了自噬體的熒光，增加了LC3-II的表達(dá)（圖3 c，d）。通過過表達(dá)H19，自噬體和自溶酶體的形成均增加（圖3e）。此外，我們通過敲除或過度表達(dá)H19來檢測MCF7/TAMR細(xì)胞的凋亡，結(jié)果沒有顯著差異（圖3f，g）。
4）H19通過表觀遺傳調(diào)控自噬相關(guān)基因Beclin1
為了確定H19調(diào)控自噬的機(jī)制，我們使用6個(gè)自噬相關(guān)基因作為假設(shè)的H19靶點(diǎn)。在這6個(gè)基因中，Beclin1與H19調(diào)控呈正相關(guān)（圖4a，b）， Beclin1蛋白表達(dá)水平隨H19敲低而降低，隨H19過表達(dá)而升高（圖4c）。
為了確定H19調(diào)控Beclin1表達(dá)的機(jī)制，我們檢測了Beclin1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化。我們發(fā)現(xiàn)通過敲除MCF7/TAMR細(xì)胞中的H19，Beclin1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化增加（圖4d）。Western blot分析顯示，與MCF7/TAMRshH19組相比，H19/SAHH和H19/DNMT3B雙敲低組Beclin1表達(dá)恢復(fù)（圖4e，f）。此外，在H19/SAHH和H19/ DNMT3B雙敲除組中LC3-II的表達(dá)也發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。我們還觀察到兩個(gè)雙敲除組Beclin1啟動(dòng)子甲基化水平的上升（圖4g）。為了進(jìn)一步研究Beclin1甲基化的機(jī)制，我們進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DNMT3B與Beclin1啟動(dòng)子結(jié)合。H19敲除后，Beclin1啟動(dòng)子的免疫沉淀DNA量增加，說明DNMT3B直接與Beclin1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，H19敲除促進(jìn)了這種相互作用（圖4h）。我們還檢測了臨床乳腺癌組織樣本中Beclin1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，抗它莫西芬組Beclin1的表達(dá)明顯高于它莫西芬敏感組（圖4i）。H19表達(dá)與Beclin1表達(dá)呈正相關(guān)（圖4k）。

5）H19/SAHH/DNMT3B軸通過自噬參與它莫西芬耐藥性

我們使用共聚焦顯微鏡分析自噬。與H19敲除組（MCF7/ TAMR-shH19+ shSAHH）相比，MCF7/TAMR-shH19+shDNMT3B和MCF7/ TAMR-shH19+ shSAHH的雙敲除組綠色和紅色熒光信號增加（圖5a）。這些數(shù)據(jù)表明，SAHH和DNMT3B均參與自噬調(diào)控。此外，為了研究SAHH和DNMT3B是否影響它莫西芬的敏感性，我們進(jìn)行了單層菌落形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)。使用CCK-8法，我們發(fā)現(xiàn)MCF7/TAMRshH19+ shSAHH和MCF7/TAMR-shH19+shDNMT3B細(xì)胞增殖速度遠(yuǎn)快于MCF7/TAMRshH19細(xì)胞（圖5b）。此外，與MCF7/ TAMR對照細(xì)胞相比，MCF7/TAMR-shH19+shSAHH和MCF7/TAMR-shH19+shDNMT3B雙敲除組均形成更多更大的菌落，而MCF7/TAMR-shH19細(xì)胞形成更少更小的菌落（圖5c-e）。綜上所述，H19通過H19 SAHHDNMT3B軸調(diào)控自噬，進(jìn)而影響MCF7/TAMR細(xì)胞對它莫西芬的耐藥性。
6）在體內(nèi)，H19的下調(diào)抑制自噬，克服它莫西芬的耐藥性

為了進(jìn)一步研究H19在體內(nèi)是否影響移植瘤對它莫西芬的敏感性，我們通過皮下注射MCF7/TAMR/Tet sh-H19細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，其中給予小鼠2 mg Dox誘導(dǎo)。與未接受Dox組相比，接受Dox組腫瘤生長明顯受到抑制（圖6a-c）。Dox組移植瘤中H19表達(dá)水平明顯低于無Dox組（圖6d）。免疫組化分析顯示，與未經(jīng)Dox誘導(dǎo)的腫瘤相比，接受Dox的腫瘤Beclin1和LC3水平下降，但P62水平升高（圖6e）。Western blot結(jié)果也一致顯示，與沒有Dox的組相比，接受Dox的組Beclin1和LC3蛋白表達(dá)水平顯著下降（圖6f）。
結(jié)論：
我們通過H19/SAHH/DNMT3B軸降低Beclin1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，證明H19表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)自噬，最終導(dǎo)致受體陽性乳腺癌細(xì)胞對它莫西芬的耐藥性。我們認(rèn)為H19是治療受體陽性乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。