circRNA的過去，現(xiàn)在和未來

 circRNA在真核生物中高豐富，其中許多是進化保守的。在后生動物中，circRNA以組織特異性方式表達，高度穩(wěn)定，并且隨著年齡在神經(jīng)組織中累積。由于反向剪接與線性剪接的競爭，circRNA生物發(fā)生可以調(diào)節(jié)順式線性RNA的衍生物。例如，最新報道證明了某些circRNA的功能：circRNA可以與microRNA相互作用，其中某些circRNA被翻譯，可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和行為。
6月份，InesLuciaPatop等人發(fā)表一篇“Past,present,andfutureofcircRNAs”的SCI文章，回顧了有關(guān)動物circRNA的當(dāng)前知識，并對潛在circRNA功能，起源概念以及該領(lǐng)域未來可能研究方向進行了總結(jié)。
一、circRNA的形成-反剪接機制
1.外顯子衍生的circRNA是通過反向剪接這類機制產(chǎn)生的，其中5’端剪接供體結(jié)合上游的3’端剪接位點。5’與3’端形成磷酸二酯鍵，進而產(chǎn)生了circRNA分子（圖1）。
circRNA在大多數(shù)真核生物中由剪接體產(chǎn)生的，但在酵母，植物和變形蟲之間產(chǎn)生的機制存在差異。在植物中，circRNA由側(cè)翼為長內(nèi)含子的區(qū)域產(chǎn)生，側(cè)翼為長內(nèi)含子的互補序列非常短或完全沒有。在古細(xì)菌中，circRNA的環(huán)化過程不依賴剪接體，其中16％左右來自編碼基因，少部分來自外顯子。在后生動物中，circRNA的產(chǎn)生源于錯綜復(fù)雜的可變剪接。由于一些基因產(chǎn)生許多可變剪接亞型和circRNA，這表明反向剪接和選擇性剪接可能在功能上相關(guān)。（全外顯子型的circRNA;內(nèi)含子和外顯子組合的EICircRNA;內(nèi)含子組成的套索型ciRNA;由病毒RNA基因組、tRNA、rRNA、snRNA等環(huán)化產(chǎn)生的circRNA）

圖1.circRNAs概覽圖。circRNA可以在反向互補重復(fù)序列或RNA結(jié)合蛋白的幫助下產(chǎn)生并從細(xì)胞核輸出（1）。在細(xì)胞質(zhì)中circRNA可能受多種因子的束縛，可以是RNA結(jié)合蛋白（2），載有miRNA作為海綿或支架的Argonaute蛋白（3），核糖體（4），Argonaute蛋白或者內(nèi)切核酸酶（5）導(dǎo)致circRNA降解（6）。circRNA與因子非降解結(jié)合，其復(fù)合物可以在細(xì)胞質(zhì)中擴散或者被主動轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的特定區(qū)域[例如突觸（7）]，從而釋放其結(jié)合的因子或被翻譯。囊泡中的circRNA或circRNA因子復(fù)合物被釋放到細(xì)胞外空間以降解circRNA（8）。然而受囊泡保護的circRNA或circRNA復(fù)合物可以到達其他細(xì)胞或組織，充當(dāng)信使分子或執(zhí)行其他未知功能（9）。
2.序列與蛋白質(zhì)驅(qū)動外顯子環(huán)化
外顯子衍生的circRNA的產(chǎn)生至少依賴其中一種機制：具有長反向重復(fù)的內(nèi)含子或與RBP的結(jié)合。這兩種機制使circRNA側(cè)翼內(nèi)含子彼此非常接近。相比連接位點的規(guī)范剪接事件，circRNA的側(cè)翼內(nèi)含子難以有效剪接，這表明線性剪接是默認(rèn)的剪接過程（2016b）。此外，可環(huán)化的外顯子在果蠅，人，小鼠，豬和植物中都有長內(nèi)含子（Jeck等，2013;Guo等，2014;Westholm等，2014;Veno等，2015;Ye等。al，2015;Zhao等，2017）。其中很多內(nèi)含子顯示廣泛的反向互補性（Capel等，1993;Jeck等，2013;Liang＆Wilusz，2014;Zhang等，2014）。此外，內(nèi)含子中反向互補重復(fù)的存在可用于預(yù)測哪些外顯子可能發(fā)生環(huán)化（Ivanov等，2015）。根據(jù)分析的物種反向互補元素顯示不同的基序富集。在人類中，88％是ALU重復(fù)，而在小鼠中，22％是ALU樣重復(fù)，而在蠕蟲中，只有11％富含一種特定基序（Jeck等，2013;Ivanov等，2015）。這些基序之間的序列比對指出了可能的進化關(guān)系（Ivanov等，2015）。有趣的是，ALU元件被認(rèn)為起源于進化過程中的轉(zhuǎn)座子（Quentin，1992）。此外，位于內(nèi)含子之間或之內(nèi)的反向元件分布對circRNA的產(chǎn)生豐度和類型有影響（Zhang等，2014）。例如，在人成纖維細(xì)胞中表達的僅有40％的circRNA表達，其側(cè)翼內(nèi)含子中含有ALU重復(fù)的基因，其中20％也是互補的（Jeck等，2013）。在豬皮質(zhì)中表達的30％的circRNA在可環(huán)化外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子中具有互補的短分散的序列（Veno等，2015）。在秀麗隱桿線蟲中觀察到的38％（Ivanov等，2015）。在可環(huán)化外顯子側(cè)翼的許多內(nèi)含子中不存在反向重復(fù)，這強烈表明外顯子環(huán)化存在其他機制。事實上，剪接因子MBL介導(dǎo)了一種替代機制（Ashwal-Fluss等，2014）。MBL與幾個高度保守的內(nèi)含子位點結(jié)合，促進其自身第二外顯子的環(huán)化。有趣的是，果蠅MBL基因產(chǎn)生mRNA編碼幾種蛋白質(zhì)，其中只有MBL-C和MBL-A才促進外顯子環(huán)化?？梢韵敕N型MBL-C和MBL-A促進內(nèi)源性人MBNL1基因的環(huán)化，表明了存在高度保守的機制（Ashwal-Fluss等，2014）。circMb1也強烈結(jié)合MBL蛋白，指出這兩個分子之間存在調(diào)節(jié)回路。哺乳動物兩種MBL同源物（MBNL1和MBNL2）在小鼠和人中產(chǎn)生circRNA（Salzman等，2012;RybakWolf等，2015）。雖然與果蠅相比，這些circRNA表達水平相對較低，但其含有兩倍以上的MBL/MBNL1/MBNL2蛋白結(jié)合位點，在不同的物種保持MB（N）L/circMbl（n）l比例（Ashwal-Fluss等，2014）。有趣的是，位于MBL第二外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子包含很可能的短反轉(zhuǎn)序列穩(wěn)定內(nèi)-內(nèi)相互作用，但可能太弱而不能在沒有MBL結(jié)合的情況下促進外顯子環(huán)化（Ashwal-Fluss等，2014）。這有力地表明MBL通過與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合并促進內(nèi)含子-內(nèi)含子相互作用來促進環(huán)化。MBL分子可以二聚化，將外顯子的兩端結(jié)合在一起以允許circRNA形成（Yuan等，2007）。其他RBP，如QKI，F(xiàn)US和ESRP1，也可以調(diào)節(jié)外顯子環(huán)化。QKI通過與環(huán)化外顯子周圍的內(nèi)含子序列結(jié)合，在人細(xì)胞培養(yǎng)物的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中促進全球circRNA的產(chǎn)生（Conn等，2015）。有趣的是，像MBL一樣，QKI可能會二聚化促進環(huán)化（Teplova等，2013）。FUS規(guī)定通過與特定外顯子-內(nèi)含子連接結(jié)合，在小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的運動神經(jīng)元中形成circRNA（Errichelli等，2017）。此外，剪接因子ESRP1通過與存在于可環(huán)化外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子中的特定位點結(jié)合來介導(dǎo)circBIRC6的環(huán)化（Yu等，2017）。最后，果蠅中漆酶-2衍生的circRNA的生物合成受不同RBP的組合調(diào)節(jié)，例如異質(zhì)核核糖核蛋白（hnRNP）和SR蛋白，表明給定外顯子的環(huán)化效率可能是由于幾種信號的整合（Kramer等，2015）。綜上所述，內(nèi)含子長反向重復(fù)和與RBP的結(jié)合（并且可能是二聚化）促進內(nèi)含子-內(nèi)含子相互作用，導(dǎo)致circRNA形成。通過內(nèi)含子-內(nèi)含子相互作用促進環(huán)化，有部分原因線性剪接的空間抑制。在這種情況下，通過促進或破壞RNA結(jié)構(gòu)的因子，以及影響內(nèi)含子-內(nèi)含子相互作用，可以影響circRNA的生物合成。RNA解旋酶DHX9通過破壞二級結(jié)構(gòu)來限制circRNA的產(chǎn)生，例如基于ALU反向重復(fù)的二級結(jié)構(gòu)（Aktas等，2017）。DHX9直接與ADAR的干擾素誘導(dǎo)型同種型（p150）相互作用，該復(fù)合物負(fù)責(zé)破壞RNA二級結(jié)構(gòu)，包括許多可促進外顯子環(huán)化的結(jié)構(gòu)。有趣的是，DHX9下調(diào)檢測到的circRNA的數(shù)量增加了一倍（約26,000到~50,000).這似乎是一種減少circRNA廣泛產(chǎn)生的校正機制，并表明一些circRNA只不過是“加工缺陷”或拼接噪音。然而，這也表明甚至在DHX9存在下產(chǎn)生的circRNA的潛在需求。涉及dsRNA結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的特定生理情況也可以改變circRNA生物發(fā)生。例如，免疫應(yīng)答因子NF90和NF110（Patin等人，2015）調(diào)節(jié)circRNA產(chǎn)生。有趣的是，這些蛋白質(zhì)在感染時與病毒RNA結(jié)合并與轉(zhuǎn)錄過程中形成的dsRNA結(jié)構(gòu)相互作用。這種結(jié)合似乎穩(wěn)定了這種瞬時RNA雙鏈體并促進了一部分circRNA的反向剪接（Li等，2017a）。有趣的是，NF90結(jié)合位點是選擇性的富含內(nèi)含子的ALU基序，支持circRNA形成外顯子。因此，這些外顯子的環(huán)化也可以進行ADAR和/或DHX9控制。此外，模擬病毒感染的聚（I：C）（聚肌苷：聚胞苷酸）刺激促進NF90/NF110向胞質(zhì)溶膠的輸出。在這些條件下，通過NF90/NF110的結(jié)合產(chǎn)生的circRNA被下調(diào)（Li等，2017a）。NF90/NF110不僅結(jié)合細(xì)胞核中的新生circRNA，還結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的至少兩個circRNA（circPOLR2A和circDHX34）。在聚（I：C）處理或水泡性口炎病毒感染時，兩種circRNA與NF90/NF110的相互作用減少。對于其他circRNA也可能是這種情況。因此，circRNA可能觸發(fā)NF90/NF110的釋放，使其在病毒感染時與病毒RNA結(jié)合（Li等，2017a）。RIG-1是一種檢測dsRNA并觸發(fā)抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)（Yoneyama和Fujita，2008），改變了HeLa細(xì)胞中的circRNA產(chǎn)生。我們對促進、干擾或調(diào)節(jié)circRNA形成的機制的理解在未來幾年中可能會增加。評估產(chǎn)生circRNA的機制以及進化保守程度是非常有趣的。此外，人們想知道具有反式功能的circRNA是否由特定類型的機制產(chǎn)生。
3.circRNA生物合成的調(diào)節(jié)
circRNA由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄并由剪接體產(chǎn)生。重要的是，形成circRNA的許多外顯子不是可變剪接的，由于CircRNA來源于mRNA前體，mRNA前體在加工過程中可以進行典型的線性剪切產(chǎn)生mRNA，也可以發(fā)生非典型剪切產(chǎn)生CircRNA。研究發(fā)現(xiàn)提高典型線性剪切的效率會導(dǎo)致產(chǎn)生CircRNA的數(shù)目顯著減少，當(dāng)外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子長度比較長時，發(fā)生典型線性剪切的效率顯著下降，而發(fā)生環(huán)化的效率顯著提高，說明轉(zhuǎn)錄時CircRNA可以與mRNA前體發(fā)生剪切競爭。
4.circRNA的降解
circRNA沒有游離末端，因此許多規(guī)范的RNA衰變途徑無法獲得。使用4-硫尿苷代謝標(biāo)記對細(xì)胞培養(yǎng)物中的60個circRNA進行的體外研究表明，大多數(shù)測定的circRNA比其線性對應(yīng)物具有更長的半衰期（18.8-23.7h）（4.0-7.4h;Enuka等，2016）。其他研究支持這一發(fā)現(xiàn)（Ashwal-Fluss等，2014;Zheng等，2016;Liang等，2017）。circRNAs在體內(nèi)可能具有更長的半衰期，特別是在不分裂的細(xì)胞類型中。實際上，大腦中circRNA的年齡依賴性積累可能是由于這些分子的高穩(wěn)定性。反之亦然，似乎circRNA不會在具有高增殖率的組織中積累（Bachmayr-Heyda等，2015）。這可能是由于如果增殖高于產(chǎn)量，可以稀釋circRNA。關(guān)于circRNA在體內(nèi)降解的機制和速率知之甚少。理論上，circRNA降解可以通過核酸內(nèi)切酶啟動，然后通過外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的組合。在體外使用RNaseH和Rrp44顯示了通過核酸內(nèi)切酶活性進行circRNA降解的第一個提示（Mackie，1998;Schaeffer等，2009）。在這兩種情況下，作者測試了人工環(huán)狀RNA構(gòu)建體，并且這些circRNA種類的切割非常低。迄今為止，小RNA介導(dǎo)的circRNA降解是最佳表征的circRNA降解途徑。然而，除了基于人工shRNA/siRNA的系統(tǒng)之外，迄今為止唯一的例子（Jeck等，2013;Legnini等，2017;Pamudurti等，2017;Yu等，2017），是miR-671對CDR1as的降解（Hansen等，2011）。值得注意的是，circRNA中的miRNA結(jié)合位點幾乎與miRNA完全互補。CDR1as的量由miR-671通過AGO2介導(dǎo)的降解直接調(diào)節(jié)（Hansen等，2013）。CDR1as，miR-671及其結(jié)合位點是高度保守的（Hansen等，2013），并且該位點的缺失導(dǎo)致CDR1a水平的顯著增加（Kleaveland等，2018）。有趣的是，CDR1as水平可能通過切片調(diào)節(jié)miR-7，這也取決于miR-671（Kleaveland等，2018）。最近的一項研究表明RNA修飾N6-腺苷甲基化（m6A）促進內(nèi)切核酸酶的募集，所述內(nèi)切核酸酶可能降解circRNA（Park等，2019）。另一項研究發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中聚（I：C）刺激或腦心肌炎病毒（EMCV）感染后circRNA的全球降解（Liu等，2019）。兩種處理均導(dǎo)致內(nèi)切核糖核酸酶RNaseL的活化和circRNA的降解。有趣的是，一部分circRNA結(jié)合并抑制PKR（蛋白激酶dsRNA激活），這是一種對病毒感染反應(yīng)的激活劑。此外，作者發(fā)現(xiàn)自發(fā)性RNaseL激活，PKR磷酸化增加和外周血中circRNA減少。
二、circRNA的特性和特征
1.circRNA的進化保守性問題（圖2）

圖2：circRNAs進化保守的多個水平。為了確定兩種或更多種生物之間的circRNA的保守水平，我們提出了幾個一般性問題：1.兩種生物體中是否存在circRNA？2.在兩種生物中，同一（同源或直系同源）基因是否產(chǎn)生circRNA？3.circRNA是否由相同的外顯子產(chǎn)生？4.潛在的特征是否得到保護？這意味著可能存在RBP和miRNA結(jié)合位點，IRES和平移終止的存在。5.是否保留了潛在的3D結(jié)構(gòu)？6.如果翻譯了circRNA，那么肽序列同源物也是如此？
2.組織，發(fā)育階段和亞細(xì)胞位置特異性表達
宿主circRNA的基因高度富集腦相關(guān)基因（Ashwal-Fluss等，2014; Westholm等，2014; Rybak-Wolf等，2015; You等，2015）。因此， circRNA在神經(jīng)組織中高度富集并不奇怪。這種CNS特異性富集似乎 是所有研究物種中circRNA的一般特征（Guo等，2014; Westholm等，2014; Rybak-Wolf等，2015; You等， 2015）。值得注意的是，腦內(nèi)circRNA的表達具有高度特異性，并 且在許多情況下，與宿主基因產(chǎn)生的線性同種型的表達無關(guān) （Rybak-Wolf等，2015; Veno等，2015; You等， 2015年）。 CNS中circRNA的顯著富集可能是由于一種或多種因素。首先，大 腦，更具體地說，神經(jīng)元在體內(nèi)顯示出最高的可變剪接率（Yeo等， 2004; Pan等，2008），并且circRNA生物發(fā)生可以被定義為特定類 型的可變剪接。另一個有趣特征是它們的亞細(xì)胞定位。與在轉(zhuǎn)錄位點附近定位的異常剪接產(chǎn)物不同，circRNA主要是細(xì)胞質(zhì)的（Nigro等，1991;Capel等，1993;Cocquerelle等，1993;Salzman等，2012;Memczak等，2013;Werfel等）。al，2016）。circRNAs對軸突，樹突和突觸的定位也很有趣。目前尚不清楚觀察到的積累是由于定向轉(zhuǎn)運還是由于這些分子在這些區(qū)室中的擴散和保留（例如，通過與膜蛋白結(jié)合或僅僅不可能返回）。進一步的遺傳和生物化學(xué)實驗應(yīng)該揭示驅(qū)動神經(jīng)元內(nèi)circRNA的亞細(xì)胞定位的機制。
3.circRNAs的翻譯
Yang等（2017）鑒定了由癌細(xì)胞系和人成纖維細(xì)胞中的一部分circRNA產(chǎn)生的幾種小肽（Yang等，2017）。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)腺苷甲基化時，起始密碼子上游的RRACH基序（R=G或A;H=A，C或U）增強了circRNA的轉(zhuǎn)錄（Yang等，2017）。大多數(shù)預(yù)測的肽可能與circRNA宿主基因編碼的蛋白質(zhì)的N-末端區(qū)域相同。這些截短的蛋白質(zhì)可能作為其線性mRNA表達的全長對應(yīng)物的競爭者。一種可能的情況可能是像Mef2這樣的轉(zhuǎn)錄因子。它的N-末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能是從circRNA表達的（Legnini等，2017），可能與全長Mef2競爭DNA結(jié)合位點，甚至可以自己發(fā)揮作用（Heetal，2011;Legnini）等，2017）。最直接的假設(shè)是circRNA編碼的蛋白質(zhì)本身具有功能?？紤]到該領(lǐng)域的快速發(fā)展，我們期望在未來幾年內(nèi)出現(xiàn)研究顯示circRNA翻譯和所得肽的生理影響。
4.circRNAs作為誘餌，轉(zhuǎn)運蛋白或支架
由于circRNA穩(wěn)定，并與RBP結(jié)合，因此它們可以作為轉(zhuǎn)錄因子的誘餌或轉(zhuǎn)運蛋白。在一些情況下，circRNA和宿主基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間可能存在直接或間接的串?dāng)_。
三、評估circRNA在體內(nèi)的功能
      1.發(fā)揮miRNA 海綿效應(yīng)，circRNA 富含miRNA 的結(jié)合位點，可以阻止miRNA與3’端非編碼區(qū)與mRNA結(jié)合，即調(diào)控miRNA下游靶基因的表達。
      2.調(diào)控蛋白結(jié)合（圖1）
      3.調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄
      4.編碼蛋白
結(jié)論:
此文獻描述的研究表明，circRNA可以作為蛋白質(zhì)的支架，可以募集其他RNA種類，并且通過miRNA的結(jié)合，可以影響特定mRNA的轉(zhuǎn)錄沉默，翻譯或衰變。神經(jīng)元中circRNA的不對稱分布表明這些RNA在細(xì)胞中的定向轉(zhuǎn)運的可能性。circRNA可以編碼蛋白質(zhì)。雖然大多數(shù)這些可能的蛋白質(zhì)的生理功能尚未確定，但它們很可能會分享由轉(zhuǎn)錄本的線性形式編碼的全長蛋白質(zhì)對應(yīng)物的一些能力。作為旁注，circRNA的編碼能力和穩(wěn)定性可用于需要產(chǎn)生肽的生物技術(shù)應(yīng)用。隨著RNA技術(shù)穩(wěn)步發(fā)展，我們預(yù)見到了一個偉大的發(fā)展未來幾年對circRNA領(lǐng)域的評價。進一步了解circRNA定位，運輸，活細(xì)胞降解，完整的circRNA相互作用組和單細(xì)胞分析是該領(lǐng)域的一些預(yù)期進展。