LncRNA新發(fā)現(xiàn)——HAND2-AS1促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的自我更新

關(guān)于癌癥的研究一直是熱門，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者們已從各種方面針對(duì)癌癥展開(kāi)了研究。近期，一篇名為“LncRNA HAND2-AS1 promotes liver cancer stem cell self-renewal via BMP signaling”的文章在雜志 The EMBO JOURNAL上發(fā)表。
這項(xiàng)研究證明了HAND2-AS1促進(jìn)肝臟CSCs的自我更新，促進(jìn)肝臟腫瘤的發(fā)生，可能成為肝癌診斷的潛在生物標(biāo)志物和HCC治療的靶點(diǎn)，為如何開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤的長(zhǎng)效治療手段提供了新思路。

摘要：
肝細(xì)胞性肝癌(HCC)是最常見(jiàn)的肝癌，具有高復(fù)發(fā)率和異質(zhì)性的特點(diǎn)。肝癌干細(xì)胞(CSCs)可能對(duì)這兩種病理特性都有很大貢獻(xiàn)，但對(duì)其自我更新維持的內(nèi)在機(jī)制卻知之甚少。在這里，我們鑒定了一種稱為HAND2-AS1的長(zhǎng)非編碼RNA(LncRNA)，它在肝臟CSCs中高度表達(dá)。人HAND2-AS1及其小鼠同源物lncHand2具有較高的保守性。HAND2-AS1是肝臟CSC自我更新維持以啟動(dòng)HCC的發(fā)展所必需的。從機(jī)制上講，HAND2-AS1將INO80染色質(zhì)重塑復(fù)合體招募到BMPR1A啟動(dòng)子上，從而誘導(dǎo)其表達(dá)并導(dǎo)致BMP信號(hào)傳導(dǎo)的激活。重要的是，通過(guò)反義寡核苷酸(ASOS)干擾HAND2-AS1的表達(dá)和通過(guò)siRNAs干擾BMPR1A的表達(dá)對(duì)人源化肝癌模型具有協(xié)同抗腫瘤作用。此外，敲除小鼠肝細(xì)胞中的lncHand2或BMPR1A可破壞BMP信號(hào)傳導(dǎo)，并抑制肝癌的發(fā)生。我們的研究結(jié)果表明，HAND2-AS1促進(jìn)肝臟CSCs的自我更新，并推動(dòng)肝臟腫瘤的發(fā)生，為HCC治療提供了一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.HAND2-AS1在肝臟CSCs中的表達(dá)明顯增加
研究者們通過(guò)芯片分析挑選了在10種CSC中上調(diào)最明顯的lncRNA（圖1A）。選擇lncRNA HAND2-AS1為此次研究的目標(biāo)，并利用原位雜交證實(shí)其在肝癌組織中高表達(dá)（圖1B）。
2.HAND2-AS1缺乏對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的HCC發(fā)展的保護(hù)作用
研究者們通過(guò)將lncHand2^flox/flox小鼠與白蛋白(Alb)-Cre小鼠雜交，有條件地刪除了肝細(xì)胞lncHand2。在LncHand2^+/+和LncHand2基因敲除(LncHand2^-/-)小鼠中使用二乙基胺(DEN)化學(xué)誘導(dǎo)腫瘤形成（圖1C）。圖E與圖F為兩組小鼠肝臟的HE染色結(jié)果和Ki67檢測(cè)結(jié)果。研究者發(fā)現(xiàn)lncHand2-RFP肝細(xì)胞主要存在于中心靜脈周圍(，在DEN治療后，lncHand2-RFP陽(yáng)性細(xì)胞從中心靜脈擴(kuò)散到整個(gè)肝臟（圖1F）。
綜上所述，HAND2-AS1促進(jìn)化學(xué)誘導(dǎo)的肝癌發(fā)展。

3.HAND2-AS1是肝臟CSC自我更新維護(hù)所必需的
HAND2-AS1缺失顯著降低了HCC細(xì)胞系（圖2A）和原發(fā)腫瘤細(xì)胞的初級(jí)(1)、次級(jí)(2)和第三(3)腫瘤圈形成，HAND2-AS1(Oelnc)的過(guò)表達(dá)挽救了因HAND2-AS1缺失而減少的球體形成。HAND2-AS1敲除顯著降低CD13⁺CD133⁺細(xì)胞的比例（CSCs；圖2B）。對(duì)不同癌細(xì)胞群進(jìn)行極端極限稀釋，然后將一系列腫瘤移植到免疫缺陷小鼠中，以測(cè)量它們形成繼發(fā)性腫瘤的能力。HAND2-AS1缺乏會(huì)損害移植后繼發(fā)性腫瘤的改建能力（圖2C和D），這種差異在連續(xù)移植中增加（圖2E和F）。圖2G為首次移植后不同組群抽搐的估計(jì)頻率。將抗Hand 2-AS1的sgRNAs導(dǎo)入含熒光素酶載體的Huh 7細(xì)胞（Huh7-Luc）中 ，HAND2-AS1缺失顯著降低了異種移植物的原位生長(zhǎng)，顯著抑制了生物發(fā)光（圖H，I）。研究者還使用反義寡核苷酸(ASOS)沉默HAND2-AS1的表達(dá)。三種不同的ASO有效地阻斷了肝臟HAND2-AS1的表達(dá)，但不能阻斷ASO的擾亂對(duì)照（圖2J），此外，HAND2-AS1 ASOS給藥顯著降低了腫瘤的生長(zhǎng)（圖2K）。HAND2-AS1的過(guò)表達(dá)顯著增加了腫瘤圈的形成（圖2L），圖M，N為在一系列有限稀釋法移植過(guò)程中HAND2-AS1過(guò)表達(dá)和對(duì)照HCC細(xì)胞中TIC的估計(jì)頻率。HAND2-AS1的過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了Huh7-Luc（圖2O和2P）。這些數(shù)據(jù)表明HAND2-AS1在肝臟CSC的自我更新維持中起著關(guān)鍵作用。

4.HAND2-AS1招募INO80復(fù)合物和INO80敲除抑制肝癌的發(fā)展
研究者們通過(guò)RNA下拉試驗(yàn)尋找潛在的HAND2-AS1結(jié)合蛋白。HAND2-AS1相關(guān)的INO80復(fù)合物的INO80和RUVBL2亞基與肝臟CSC相關(guān)（圖3A）。Western blotting（圖3B）和原代肝細(xì)胞中RNA結(jié)合蛋白的綜合鑒定（圖3C）證實(shí)了它們的相互作用。HAND 2-AS1與INO 80共定位于HCC腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中（圖3D）。圖E為HAND 2-AS1的INO 80結(jié)合區(qū)的定位分析，用RNA電遷移率變化法（EMSA；圖3F和G）進(jìn)一步證實(shí)HAND 2-AS1片段與INO 80的結(jié)合。圖H為用RNA下拉試驗(yàn)檢測(cè)INO 80與HAND 2-AS1突變?cè)诘?外顯子NT 83-242處的相互作用區(qū)域的結(jié)果。
為進(jìn)一步確定INO 80在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，研究者們用shRNAs方法使肝癌原發(fā)細(xì)胞中INO 80的表達(dá)減弱，INO 80缺乏對(duì)異種移植物的原位生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，對(duì)生物發(fā)光有明顯的抑制作用（圖3i和J）。INO80基因敲除顯著降低了化學(xué)誘導(dǎo)的肝腫瘤生長(zhǎng)和數(shù)量（圖3K）。這些數(shù)據(jù)表明，INO 80促進(jìn)了肝臟癌的發(fā)生和腫瘤的發(fā)展。

5.HAND2-AS1將INO80復(fù)合物招募到BMPR1A啟動(dòng)子上啟動(dòng)其表達(dá)和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
為了鑒定HAND2-AS1的靶點(diǎn)，研究者們建立了HAND2-AS1和INO80耗竭的HCC原代CSC細(xì)胞，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組芯片分析。HAND2-AS1和INO80的缺乏表現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)錄組模式（圖4A），表明HAND2-AS1和INO80之間存在功能關(guān)系。GO分析顯示當(dāng)HAND2-AS1和INO80都被耗盡時(shí)，BMP信號(hào)傳導(dǎo)中的靶基因被顯著抑制（q值=0.0003；圖4B），表明BMP信號(hào)傳導(dǎo)參與了肝臟CSC的調(diào)節(jié)。
為了研究HAND2-AS1的基因組結(jié)合區(qū)，用RNA純化(ChIRP)-seq技術(shù)對(duì)肝癌腫瘤球細(xì)胞和來(lái)自HCC原發(fā)腫瘤樣本的肝臟CSC中對(duì)HAND2-AS1進(jìn)行染色質(zhì)分離。與LacZ對(duì)照組相比,HAND 2-AS1在肝癌腫瘤球細(xì)胞中有顯著的富集峰（圖4C）。ChIRPseq數(shù)據(jù)顯示HAND2AS1可以結(jié)合基因組中的不同位點(diǎn)（圖4D）。分析BMP信號(hào)的ChiRP-seq基因，發(fā)現(xiàn)HAND2-AS1 RNA在BMPR1A、SMAD1和SMAD9基因座上富集（圖4E）。圖F為肝臟CSCs中HAND2-AS1 RNA結(jié)合BMPR1A啟動(dòng)子的凝膠分析結(jié)果（LacZ和PVT1作為陰性對(duì)照）。
此外，HAND 2-AS1缺失抑制了BMPR1A的表達(dá)和BMP信號(hào)的激活（圖4G）。圖4H為BMPR1A與對(duì)照組和HAND2-AS1-敲除肝臟CSC中INO80復(fù)合物的相互作用的ChIRP免疫印跡分析結(jié)果。EMSA顯示HAND2-AS1與INO80和BMPR1A啟動(dòng)子區(qū)域形成復(fù)合物（圖4I），而INO80和HAND2-AS1的過(guò)表達(dá)并沒(méi)有增強(qiáng)BMPR1A啟動(dòng)子缺失的肝細(xì)胞中BMPR1A的表達(dá)（圖4J），INNO80缺乏顯著抑制BMP信號(hào)（圖4K）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，HAND 2-AS1在BMPR1A啟動(dòng)子上激活I(lǐng)NO 80復(fù)合物，啟動(dòng)其表達(dá)并激活BMP信號(hào)。

6.BMPR1A通過(guò)BMP信號(hào)通路促進(jìn)肝臟CSCs自我更新
研究者們根據(jù)前人的研究數(shù)據(jù)分析了BMPR1A在HCC腫瘤和癌周組織中的表達(dá)——BMPR1A在肝癌中高表達(dá)（圖5A），同時(shí)BMPR1A也是肝癌的理想預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)（圖5B），免疫組化進(jìn)一步證實(shí)其在肝癌組織中的高表達(dá)（圖5C）。在HCC原代細(xì)胞中沉默BMPR1A并建立穩(wěn)定沉默的細(xì)胞系，可以觀察到BMPR1A耗竭顯著抑制了球體的形成和腫瘤的啟動(dòng)能力（圖5D和E），BMPR1A耗盡顯著減少腫瘤Huh7-Luc，顯著抑制生物發(fā)光（圖5F和G）。通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯在體內(nèi)產(chǎn)生BMPR1A基因敲除小鼠，與WT相比較，Bmpr1a缺失降低了DNE治療后的肝癌形成能力（圖5H）。圖I為10個(gè)月大DEN治療的WT和Bmpr1a^-/l-小鼠肝臟切片中的代表性H&E和Ki67抗體免疫組織學(xué)染色結(jié)果。BMP抑制劑顯著地減少了腫瘤層的形成（圖5J）。由這些數(shù)據(jù)可以看出，Bmpr1A通過(guò)BMP信號(hào)通路促進(jìn)肝CSC自我更新和肝癌的發(fā)展。

7.HAND2-AS1的Asos和抗BMPR1A的siRNAs對(duì)人源化肝癌模型具有協(xié)同抗腫瘤作用
為了研究HAND 2-AS1缺失在肝癌治療中的作用，研究者們使用Huh7-Luc和PDX模型，重新描述了人肝癌的復(fù)雜性和表型異質(zhì)性（圖6A）。圖6B為ASO/siRNA治療時(shí)間表圖示。與載體治療組相比，添加ASOs的HAND2-AS1或針對(duì)BMPR1A的siRNAs可抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤數(shù)量（圖6C-F），用加擾RNA處理HAND2-AS1的ASO和/或針對(duì)BMPR1A的siRNAs獲得了與載體處理組相似的結(jié)果（圖6C和D）。HAND2-AS1 ASO和BMPR1A siRNAs的組合對(duì)人源化HCC模型顯示了協(xié)同治療作用（圖6C-F）。HAND 2-AS1 Asos和BMPR1A siRNAs顯著抑制異種移植物細(xì)胞增殖（圖6G）以及HAND 2-AS1和BMPR1A的表達(dá)（圖6H）。與載體處理組相比，HAND2-AS1 ASO和BMPR1A siRNAs處理延長(zhǎng)了存活率（圖6I和J）。綜上可知，靶向HAND 2-AS1和BMPR1A對(duì)人源化肝癌模型具有協(xié)同抗腫瘤作用。

結(jié)論：
這項(xiàng)研究證明了HAND2-AS1的ASOS與針對(duì)BMPR1A的siRNAs結(jié)合可以顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)，從而提高PDX肝癌模型的整體生存率。此外，僅應(yīng)用ASOS對(duì)HAND2-AS1具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，表明ASOS靶向lncRNAs可能是肝細(xì)胞癌的潛在治療靶點(diǎn)。然而，如何將基于RNA的寡核苷酸有效地傳遞到腫瘤中，并保持對(duì)腫瘤的長(zhǎng)效作用，仍然需要腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的深入研究。綜上所述，HAND2-AS1促進(jìn)肝臟CSCs的自我更新，促進(jìn)肝臟腫瘤的發(fā)生，可能成為肝癌診斷的潛在生物標(biāo)志物和HCC治療的靶點(diǎn)。