重磅：Nature揭示H3K36me3介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過程中RNA m6A修飾

  近期，m6A修飾領(lǐng)域大牛在nature上發(fā)表了關(guān)于RNA上m6A修飾時如何添加到特定部位的研究結(jié)果（doi: 10.1038/s41586-019-1016-7）。小編在這分享給大家，一定能對大家的研究有所幫助。
  m6A是真核生物mRNA上的一種最常見的修飾，越來越多的研究揭示了m6A在mRNA穩(wěn)定性、翻譯，以及在細胞分化、胚胎發(fā)育、應(yīng)答等過程中發(fā)揮著重要作用。m6A主要集中于含RRACH的motif上，而且主要分布于CDS和3’UTR區(qū)域。雖然體外實驗中，METTL3–METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶能識別該motif，但體內(nèi)只有部分motif上存在m6A，而且分布區(qū)域存在特異性。因此作者提出問題：體內(nèi)特定轉(zhuǎn)錄本和位點的m6A修飾是如何調(diào)控的？
  通過比較m6A與各種類型的組蛋白修飾的分布情況，作者發(fā)現(xiàn)H3K36me3與m6A的分布存在69.2%的重合（圖一）。同時，在不同組織和細胞系中，SETD2(注：H3K36me3主要甲基轉(zhuǎn)移酶)和METTL3、METTL14及WTAP的mRNA水平呈現(xiàn)正相關(guān)。因此作者猜想二者存在聯(lián)系。

                                               圖1 m6A與常見組蛋白修飾分布重合分析結(jié)果
  通過敲除SETD2或過表達KDM4A降低細胞內(nèi)H3K36me3水平后，細胞內(nèi)總RNA和poly-A RNA上的m6A修飾水平也顯著降低；該降低效果與單獨敲除各m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的作用一致（圖2a）。小鼠模型也得到同樣的結(jié)果。在SETD2敲除細胞中回復(fù)過表達SETD2可以回復(fù)H3K36me3和m6A水平（圖2b）。反過來，敲低m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（the m6A methyltransferase Complex, MTC）成員后對H3K36me3整體水平無顯著影響。

                                               圖2 H3K36me3影響m6A水平
  m6A-seq和H3K36me3 ChIP-seq結(jié)果顯示了二者分部有顯著的相關(guān)性。在SETD2敲除后，H3K36me3下降的區(qū)域中約有50%區(qū)域的m6A水平也顯著下降。而KDM4A（H3K36me3主要去甲基化酶）過表達后，也是同樣的表型。接下來作者通過核酸酶活性突變的Cas9蛋白融合表達SETD2和KDM4A，然后使用sgRNA導(dǎo)向特異位點實現(xiàn)該位點的H3K36me3改變。在原本無H3K36me3修飾的位點特異性的導(dǎo)入SETD2并上調(diào)H3K36me3后，該位點轉(zhuǎn)錄的mRNA上的m6A修飾也從無法檢測變?yōu)轱@著上升；而導(dǎo)入KDM4A的結(jié)果則相反。這些結(jié)果
進一步說明了H3K36me3能上調(diào)進該部位轉(zhuǎn)錄本的m6A水平。

                                      圖3 位點特異修飾H3K36me3能調(diào)節(jié)對應(yīng)m6A水平
  敲低SETD2后，作者檢測到MTC與其靶向mRNA的結(jié)合能力顯著降低；而MTC基因的表達和蛋白間相互作用沒有收到影響。因此作者推測H3K36me3能夠招募MTC至相應(yīng)部位。作者進一步研究發(fā)現(xiàn)H3K36me3能直接與MTC結(jié)合，而且不依賴于RNA或DNA。而且MTC只特異性的結(jié)合H3K36me3，而不結(jié)合H3K36me1和H3K36me2。MTC中，METTL14負責(zé)識別H3K36me3。那這種識別是否是直接相互作用呢？作者沒有發(fā)現(xiàn)已知的H3K36me3 reader能與METTL14相互作用，但在體外實驗中作者檢測到了H3K36me3和METTL14之間的直接相互作用。截斷實驗也進一步分析了METTL14識別H3K36me的核心區(qū)域。如圖4所示。

                                                圖4 METTL14與H3K36me3作用機制研究
  既然METTL14能結(jié)合H3K36me3，那它是否與染色質(zhì)結(jié)合呢？作者使用HA標(biāo)簽抗體通過ChIP-seq檢測了METTL14在染色質(zhì)上的定位，而這一分布與H3K36me3有顯著的相關(guān)性。而PAR-CLIP檢測METTL14在RAN上的分布也于該結(jié)果一致。如圖5所示。

                                      圖5 METTL14和染色質(zhì)和RNA定位與H3K36me3和m6A相關(guān)性分析
  文獻報道中，H3K36me3參與的功能較多，其中包括轉(zhuǎn)錄延伸。作者探討了POII S2P在METTL14調(diào)節(jié)這一過程中的作用。最后得出結(jié)論：METTL14能直接識別和結(jié)合H3K36me3而不依賴于POII S2P，進而在POII介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸過程中直接甲基化新生RNA（圖6）。最終，作者在胚胎干細胞的更新和分化過程中探究了這一分子機制的生物學(xué)意義。通過敲低SETD2降低H3K36me3水平后，胚胎干細胞中m6A水平和分化狀態(tài)都顯著下降。

                                        圖6 METTL14在轉(zhuǎn)錄過程中識別H3K36me3并催化m6A模式圖

                                     圖7 下調(diào)H3K36me3能減少m6A水平和抑制小鼠胚胎干細胞分化
  該研究不僅系統(tǒng)地揭示了m6A主要分布于CDS和3’UTR區(qū)域的分子機制，更是發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)上的組蛋白修飾與RNA上的修飾存在調(diào)節(jié)關(guān)系。這為我們研究基于表達調(diào)控提供了新的思路。