基金申請新方向——細(xì)胞焦亡

  2019年6月發(fā)表在Immunity 的一篇文章，論文名字為”Inflammasome Activation Triggers Blood Clotting and Host Death through Pyroptosis“(影響因子： 21.522)。該論文主要研究了兩條促凝血通路，簡來說：炎性體的過度激活導(dǎo)致凝血，從而引發(fā)了宿主死亡。主要思路如下圖：

  首先，我們先來了解一下細(xì)胞焦亡的概念，細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞壞死的區(qū)別：細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)是一種最新發(fā)現(xiàn)的炎癥細(xì)胞程序性死亡方式，主要通過炎癥小體介導(dǎo)包含Caspase-1在內(nèi)的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內(nèi)的多種Gasdermin家族成員發(fā)生剪切和多聚化，造成細(xì)胞穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。相比于細(xì)胞凋亡(apoptosis)，細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快，并會(huì)伴隨著大量促炎癥因子的釋放。
細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生腫脹，在細(xì)胞破裂之前，細(xì)胞上形成凸出物，之后細(xì)胞膜上形成孔隙，使細(xì)胞膜失去完整性，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，此時(shí)，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，隨著形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞核固縮，DNA斷裂。
  本文研究的細(xì)胞焦亡的途徑主要有兩種，我們通過促凝血中的每一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，分別用小鼠基因缺失型來驗(yàn)證每個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的重要性，從而證明整個(gè)促凝血通路的作用機(jī)制。

技術(shù)路線：

結(jié)果:
一、細(xì)菌桿狀蛋白EprJ激活炎癥小體導(dǎo)致全身性凝血

圖1.體內(nèi)EprJ的給藥引起系統(tǒng)性凝血(A–E) 給小鼠(C57BL/6J)靜脈注射PBS(Ctrl)或EprJ(每只小鼠300 ng LFn-EprJ加3 mg PA)。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測量凝血酶原時(shí)間(A)，血漿纖維蛋白原濃度(B)，血漿TAT濃度(C)，EprJ注射前后的總血小板計(jì)數(shù)(D)和血漿微泡(MVs)(E)中的TF活性。實(shí)心圓圈代表個(gè)別小鼠；橫線代表組均值。
二、桿狀蛋白誘導(dǎo)的凝血激活需要Caspase-1
  炎性小體在Caspase-1缺陷小鼠EprJ誘導(dǎo)的凝血中的作用。EprJ引起的凝血依賴于caspase-1，caspase-1是炎性體活性的關(guān)鍵蛋白酶。

圖2. Cprase-1是EprJ誘導(dǎo)的血液凝固和致命性所必需的A.向C57BL/6J小鼠(野生型[WT])或Casp1/11^-/-小鼠靜脈注射從C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J小鼠(GFP)和用Alexa Fluor 568標(biāo)記的(紅色)抗纖維蛋白單克隆抗體(59D8)，然后靜脈注射EprJ。使用活體顯微鏡檢查提睪血管中的血栓形成。 EprJ注射后15min和60min，在同一位置獲取圖像。B.用EprJ靜脈注射C57BL/6J小鼠(WT)或Casp1/11^-/-小鼠。90min后，對小鼠實(shí)施euthanasia并用PBS灌注，然后在生理壓力下用10％福爾馬林固定灌注45min。用抗血纖蛋白單克隆抗體(59D8)對肝切片進(jìn)行免疫染色。野生型小鼠的肝臟中顯示纖維蛋白沉積(箭頭)。C.用EprJ靜脈注射C57BL/6J小鼠(WT)或Casp1/11^-/-小鼠。 90min后，對小鼠實(shí)施euthanasia，并分離組織。用抗纖維蛋白單克隆抗體(59D8)通過免疫印跡檢測組織裂解物中的纖維蛋白。(D–F) 將C57BL/6J小鼠(WT)，Casp1/11^-/-小鼠，Casp11缺陷小鼠和TLR4缺陷小鼠靜脈注射PBS或EprJ。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測量凝血酶原時(shí)間(D)，血漿纖維蛋白原濃度(E)和血漿TAT濃度(F)。G.給C57BL/6J小鼠(WT)或Casp1/11^-/-小鼠靜脈注射致死劑量的EprJ。顯示了用EprJ攻擊的小鼠的Kaplan-Meier生存圖。

三、炎癥激活通過細(xì)胞焦亡促進(jìn)凝血和致死性
   caspase-1裂解GSDMD并觸發(fā)細(xì)胞凋亡，這是一種程序性細(xì)胞死亡形式，具有與壞死相似的形態(tài)。我們使用Gsdmd^-/-小鼠檢驗(yàn)了GSDMD依賴性細(xì)胞焦亡會(huì)驅(qū)動(dòng)炎癥引起某些凝血和致死性的假說，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSDMD缺乏小鼠阻止了大腸桿菌感染誘導(dǎo)的凝血系統(tǒng)性激活。

圖3. GSDMD依賴的細(xì)胞凋亡對于炎性體驅(qū)動(dòng)的凝血和致命性至關(guān)重要A.EprJ靜脈注射C57BL/6J(WT)或GSDMD^-/-小鼠。 90min后，對小鼠實(shí)施euthanasia，并分離組織。用抗纖維蛋白單克隆抗體(59D8)通過免疫印跡檢測組織裂解物中的纖維蛋白。B.D C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠靜脈注射PBS(Ctrl)或EprJ。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測量凝血酶原時(shí)間，血漿纖維蛋白原濃度(C)和血漿TAT濃度(D)。(E和F) 向C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠靜脈注射PBS(Ctrl)或BsaK或PrgJ。注射后90min收集血液。測量凝血酶原時(shí)間(E)和血漿TAT濃度(F)。(G和H) 給C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠靜脈注射致死劑量的EprJ(G)或BsaK(H)。顯示了用EprJ攻擊的小鼠的Kaplan-Meier生存圖。

四、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是炎性體激活誘導(dǎo)的凝血和致死性的主要貢獻(xiàn)者
  單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在炎癥小體檢測細(xì)菌感染中至關(guān)重要。為了確定單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對EprJ誘導(dǎo)的凝血的貢獻(xiàn)，我們使用Clodronic Acid鹽脂質(zhì)體的給藥在24h內(nèi)使血液單核細(xì)胞減少了90％。通過PT，血漿纖維蛋白原和TAT濃度的測量，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的預(yù)耗盡顯著減弱了EprJ誘導(dǎo)的凝血(圖4A-4C)，支持了單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞在EprJ誘導(dǎo)的凝血中的核心作用，提高了用致死劑量的EprJ攻擊的小鼠的存活率，從而確定了它們在炎性體誘導(dǎo)的致死性中的重要性(圖4D)。

五、炎性體激活后，凝血激活需要巨噬細(xì)胞衍生的TF。
  單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是體內(nèi)TF的主要來源。巨噬細(xì)胞可在體外通過ATP激活caspase-1時(shí)釋放TF陽性MV。從巨噬細(xì)胞釋放TF需要caspase-1依賴性炎癥小體活性。表明炎癥小體激活可能是人類和嚙齒類動(dòng)物中凝血起始的保守機(jī)制。甘氨酸緩沖阻止了TF從野生型細(xì)胞中釋放(圖4G)，表明TF不是通過GSDMD形成的孔釋放，而是TF釋放需要細(xì)胞膜破裂。

圖4.巨噬細(xì)胞凋亡通過促進(jìn)TF陽性小囊泡的釋放在炎性體誘導(dǎo)的凝血中起關(guān)鍵作用(A–C) 在靜脈注射PBS(Ctrl)或EprJ之前24h，將C57BL/6J小鼠靜脈注射對照脂質(zhì)體(Lipo)或含Clodronic Acid的脂質(zhì)體(Cldn)。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測凝血酶原時(shí)間(A)，血漿纖維蛋白原濃度(B)和血漿TAT濃度(C)。C.在靜脈內(nèi)注射致死劑量的EprJ之前24h，向C57BL/6J小鼠靜脈內(nèi)注射對照脂質(zhì)體(Lipo)或含Clodronic Acid的脂質(zhì)體(Cldn)。注：Cldn可以消耗單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。D. 將C57BL/6J(WT)，Casp1/11^-/-，Casp11^-/-小鼠和TLR4^-/-小鼠的BMDM與各種T3SS桿狀蛋白(100 ng/mL LFn-桿狀蛋白加1 mg / mL PA孵育)45min。通過熒光免疫印跡檢測上清液中的TF和p20 caspase-1。在免疫印跡之前，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液沉淀以濃縮蛋白質(zhì)。E.將來自C57BL/6J(WT)和TLR4^-/-小鼠的BMDM與各種T3SS桿狀蛋白溫育45min。通過熒光免疫印跡檢測上清液中的TF和p20 caspase-1。F.將來自C57BL/6J(WT)和GSDMD^-/-小鼠的BMDM與EprJ孵育45min。通過熒光免疫印跡檢測上清液中的TF和p20 caspase-1。甘氨酸(+)表示添加5 mM甘氨酸作為滲透保護(hù)劑，以防止與細(xì)胞焦亡相關(guān)的膜破裂。G. 將THP-1細(xì)胞與T3SS桿狀蛋白EprI(1mg/mL LFn-EprI加1mg/mL PA)孵育45min。在免疫印跡分析之前，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液沉淀以濃縮蛋白質(zhì)。H.將THP-1與EprI一起溫育45min。從上清液中分離出MV，并測量TF活性。(J)血漿MV TF活性。向C57BL/6J(WT)，Casp1/11^-/-和GSDMD^-/-的小鼠靜脈注射EprJ。EprJ注射后90min收集血液。從血液中分離出MV，并測量TF活性。

六、組織因子對炎性體致死率負(fù)責(zé)
  GSDMD-依賴的細(xì)胞凋亡促進(jìn)了TF陽性MV的釋放，釋放到血漿中的MV TF主要來自焦單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。TF可能通過誘導(dǎo)凝血而導(dǎo)致炎性體激活誘導(dǎo)的死亡。

圖5.組織因子抑制作用可防止炎性體誘導(dǎo)的凝血和致命性(A–B) TF的藥理抑制作用。給C57BL/6J小鼠靜脈注射大鼠IgG或大鼠抗小鼠TF中和抗體1H1(8 mg/kg)。 2h后，給小鼠靜脈內(nèi)注射EprJ。 EprJ注射后90min收集血液。測量凝血酶原時(shí)間(A)和血漿TAT濃度(B)。C.給C57BL/6J小鼠靜脈注射大鼠IgG或1H1(8 mg/kg)。2h后，給小鼠靜脈注射致死劑量的EprJ。(D–F) 通過將B6.Cg-Tg(UBC cre/ERT2)1Ejb/J Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與TF浮選小鼠雜交產(chǎn)生了可誘導(dǎo)的TF缺陷小鼠。 TF缺陷型小鼠或野生型同窩動(dòng)物靜脈注射EprJ。 EprJ注射后90min收集血液。測量凝血酶原時(shí)間(D)和血漿TAT濃度(E)。F.TF致死小鼠或野生型同窩小鼠注射致死劑量的EprJ。

七、LPS通過非典型的炎性體途徑誘導(dǎo)凝血。
革蘭氏陰性細(xì)菌通過多種機(jī)制激活炎癥小體。LPS通過依賴于炎癥小體的TF釋放觸發(fā)凝血。因?yàn)長PS通過炎癥小體激活引起凝結(jié)，所以我們假設(shè)GSDMD依賴性細(xì)胞焦亡也通過Gsdmd ^-/-小鼠驅(qū)動(dòng)LPS誘導(dǎo)的非典型凝結(jié)和致死性。 GSDMD缺乏癥對LPS誘導(dǎo)的血細(xì)胞減少癥表現(xiàn)出適度但重要的保護(hù)作用(圖6I)。
   

圖6. LPS激活非規(guī)范性炎癥小體會(huì)觸發(fā)血液凝結(jié)(A–D) 將C57BL/6J小鼠(WT)，Casp11^-/-和TLR4^-/-小鼠腹膜內(nèi)注射4 mg/kg Poly(I:C)進(jìn)行初免。 8h后，給小鼠腹膜內(nèi)注射PBS(Ctrl)或50mg / kg LPS。注射PBS或LPS后4h收集血液。測量LPS注射前后的凝血酶原時(shí)間(A)，血漿纖維蛋白原濃度(B)，血漿TAT濃度(C)和總血小板計(jì)數(shù)(D)。E.將來自C57BL/6J(WT)，Casp11^-/-，TLR4^-/-和GSDMD^-/-小鼠的BMDM與Poly(I:C)(1 mg/mL)孵育。5h后將細(xì)胞用PBS(Ctrl)或LPS(2mg / mL)轉(zhuǎn)染。在免疫印跡之前，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液沉淀以濃縮蛋白質(zhì)。(F-I) 將C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠腹膜內(nèi)注射4 mg/kg Poly(I:C)進(jìn)行引發(fā)。8h后，給小鼠腹膜內(nèi)注射PBS(Ctrl)或50mg/kg LPS。注射PBS或LPS后4h收集血液。測量LPS注射前后的凝血酶原時(shí)間(F)，血漿纖維蛋白原濃度(G)，血漿TAT濃度(H)和總血小板計(jì)數(shù)(I)。(J) 在腹膜內(nèi)注射4 mg / kg Poly(I:C)前24h，向C57BL / 6J小鼠靜脈內(nèi)注射對照脂質(zhì)體(Lipo)或含Clodronic Acid的脂質(zhì)體(Cldn)。注射 Poly(I:C) 6h后，給小鼠注射致死劑量的LPS。(K) 由典型和非典型炎癥小體激活觸發(fā)的凝血模型。

結(jié)論：
(1)炎癥體激活是炎癥和血液凝結(jié)之間的重要聯(lián)系。
(2)脂多糖通過非典型的炎性體途徑可以激活Caspase-11，釋放GSDMD（裂解骨泌素D），從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，炎癥激活刺激焦磷酸巨噬細(xì)胞釋放的組織因子穿過細(xì)胞膜，觸發(fā)凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致宿主死亡。
(3)革蘭氏陰性菌釋放的T3SS桿狀蛋白通過典型的炎性體途徑激活Caspase-1，釋放GSDMD（裂解骨泌素D），從而從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，炎癥激活刺激焦磷酸巨噬細(xì)胞釋放的組織因子穿過細(xì)胞膜，觸發(fā)凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致宿主死亡。