LncRNA NEAT1與多發(fā)性骨髓瘤

   長非編碼RNA在多發(fā)性骨髓瘤（MM）中的生物學(xué)作用和治療潛力是一個尚需研究的問題。針對NEAT1沉默的研究可以為抗MM的治療方法提供新的思路。 近日，一篇名為“Long non-coding RNA NEAT1 targeting impairs the DNA repair machinery and triggers anti-tumor activity in multiple myeloma”的研究向我們展示了最新的研究結(jié)果。

技術(shù)路線：

   與正常骨髓漿細胞相比，NEAT1在MM和PCL患者中過表達。將NEAT1表達分析擴展到具有代表性的廣泛的人類血液腫瘤，包括MM(n=20)，淋巴瘤(n=8)和白血病(n=7)細胞系。按照之前描述的基于定量實時PCR的方法，發(fā)現(xiàn)在人骨髓瘤細胞系（HMCL）中NEAT1的全局表達比在其他腫瘤細胞系中高出約六倍（圖1）。

   據(jù)報道，g#N1可以使NEAT1沉默。研究者使用亞細胞毒性濃度（5μM）評估g#N1_E傳遞的時間依賴性效應(yīng)。如圖2a所示，NCI-H929和AMO-1細胞系中g#N1_E傳遞顯著下調(diào)了兩種NEAT1亞型的表達，導(dǎo)致lncRNAs沉默4天后細胞活力降低（圖2b，c）?；?/span>BM對MM腫瘤細胞的支持作用，接下來在BM環(huán)境下測試了NEAT1的沉默。如圖2d所示，g#N1_E處理也抑制了NCI-H929和AMO-1細胞系與HS-5細胞共培養(yǎng)時的生長和生存。這些數(shù)據(jù)表明，NEAT1靶向可能能夠克服BM環(huán)境對MM細胞的增殖和促進生存的影響。體內(nèi)實驗證實，通過使用從g#N1_E的體外活性衍生的治療計劃，并基于為類似的LNA ASO設(shè)計的方案，可以發(fā)現(xiàn)g#N1_E減少了AMO-1異種移植物的生長（圖2e）。最后，評估裸露的g#N1_E對來自MM患者的CD138+細胞的抗MM作用。在g#N1_E暴露6天后，NEAT1下調(diào)導(dǎo)致明顯的細胞死亡，證實了對HMCL的影響（圖2f）。

   對NEAT1耗盡的MM細胞進行細胞周期分析。如圖3a所示，在NEAT1敲除6天后，測量到細胞周期相位分布的強烈調(diào)整。此外，細胞熒光分析也顯示在兩種細胞系中S期減少，這進一步證實了BrdU攝取減少（圖3b）。在NEAT1沉默5天后，通過流式細胞術(shù)、western blot分析和caspase-3和-7活性測定分析NEAT1對細胞凋亡的影響。流式細胞術(shù)分析顯示，與相對陰性對照相比，AMO-1，NCI-H929，沉默細胞的凋亡率顯著增加（圖3c）。WB法測定caspase 3和7裂解，結(jié)果顯示在NEAT1沉默后PARP裂解（圖3d）。在體內(nèi)也觀察到了減少的增殖和凋亡特征，NEAT1KD既增加了caspase-3，又減少了AMO-1異種移植細胞的Ki67染色（圖3e）。NEAT1耗盡也在MM患者衍生的腫瘤中觸發(fā)caspase3和7切裂解（圖3f）。

   為了確定MM中NEAT1下游相關(guān)通路，對NEAT1耗竭后NCI-H929和AMO-1的基因表達譜分析。在用g#N1_E LNA-gapmeR處理96小時的不同HMCL和其他血液腫瘤中，通過qRT-PCR驗證了五個基因的調(diào)節(jié)。只有表現(xiàn)出生物學(xué)反應(yīng)的細胞系(就降低的活性而言)在g#N1_E LNA-gapmeR給藥后也表現(xiàn)出這些基因的下調(diào)（圖4a）。對從AMO-1小鼠移植瘤細胞中提取的RNA進行的qRT-PCR分析證實，在g#N1_E LNA-gapmeR給藥后，這些基因下調(diào)，用g#N1_E LNAgapmeR處理48小時的原代腫瘤細胞分析也證實了這些發(fā)現(xiàn)（圖4b）。。
   聚焦于這些途徑，可以發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白隨著激酶蛋白CHK1和Chk2的磷酸化部分的降低而減少，這些蛋白都參與了DNA損傷檢查點；發(fā)現(xiàn)RPA32和BRCA1的活性量下調(diào)，這兩種蛋白分別是DNAdamage傳感器蛋白和DNA修復(fù)機制的必要效應(yīng)器（圖5a）。
為了評估NEAT1沉默引起的DNA修復(fù)過程的假設(shè)損傷是否與DNA損傷增加相關(guān)，評估當(dāng)DNA損傷發(fā)生時被磷酸化的H2A.X蛋白的表達和模式分布。如圖5b的WB所示，NEAT1下調(diào)導(dǎo)致遺傳毒性應(yīng)激增加。接下來研究了Oaparib（一種PARP抑制劑，在HR缺乏的腫瘤中誘導(dǎo)合成致死性）在NEAT1耗竭細胞中的作用。在NEAT1存在或不存在的情況下增加了這種藥物的濃度，處理了AMO-1和NCI-H929，然后評估每個樣品中的細胞存活，g#N1_E LNA-gapmeR與olaparib的組合在幾乎所有的測試組合中都產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)（圖5c）。

   為了評估NEAT1在MM細胞耐藥機制中的作用，評估與MM治療的最常用藥物，即Bortezomib，Carfilzomib和Melphalan的協(xié)同效應(yīng)的發(fā)生情況。為此，用存在或不存在NEAT1 gapmeR的不同濃度的每種藥物處理NCI-H929和AMO-1細胞系，然后評估每個樣品中的活細胞。結(jié)果，g#N1_E LNA-gapmeR與carfilzomib、melphalan或bortezomib的組合產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)（圖6a）。

   為了深入了解NEAT1抑制與卡非羅米和硼替佐米聯(lián)合使用的協(xié)同作用，將蛋白酶體抑制劑通過靶向ssDNA/RPA32信號中間體來破壞同源DNA重組?；?/span>g#N1_E LNA-gapmeR誘導(dǎo)的RPA32活性量的下調(diào)（圖5a），評估了結(jié)合蛋白酶體抑制劑和NEAT1反義寡核苷酸對pRPA32的影響。如圖6b，與各單獨處理相比，卡非唑米和硼替佐米聯(lián)合NEAT1抑制進一步降低了pRPA32在NCI-H929和AMO-1中的比例。