m6A的套路—你get到了嗎？
N6-甲基腺苷(m6A)甲基化，一種具有新表觀遺傳功能的修飾，據(jù)報(bào)道參與肝細(xì)胞癌(HCC)的腫瘤發(fā)生，為該疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。m6A甲基化的關(guān)鍵成分，腎母細(xì)胞瘤1相關(guān)蛋白(WTAP)在HCC尚未得到很好的研究。本實(shí)驗(yàn)研究了WTAP在肝癌中的生物學(xué)作用和潛在機(jī)制。該研究發(fā)現(xiàn)WTAP在HCC中顯著上調(diào)，并促進(jìn)肝癌的發(fā)展。在功能上，WTAP促進(jìn)了HCC細(xì)胞的體外和體內(nèi)增殖能力和腫瘤生長(zhǎng)。該研究首次報(bào)道WTAP介導(dǎo)的m6A甲基化在HCC腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，并強(qiáng)調(diào)WTAP是HCC治療的潛在治療靶點(diǎn)。（IF=10.679）
技術(shù)路線：
結(jié)果：
一、WTAP過(guò)度表達(dá)與HCC預(yù)后不良相關(guān)
從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)集(Roessler liver)和癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)分析WTAP在人類HCC樣本中的基因表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤組織中WTAP表達(dá)顯著增高(圖1a)。WTAP蛋白水平在HCC組織中也顯著上調(diào)(圖1b)，這進(jìn)一步被東京都市區(qū)隊(duì)列的IHC染色證實(shí)(圖1c，d)。Kaplan-Meier分析顯示，WTAP表達(dá)水平較高的患者總體生存率和無(wú)病生存率較低(圖1e)。此外，WTAP的過(guò)度表達(dá)被發(fā)現(xiàn)是骨關(guān)節(jié)炎的獨(dú)立預(yù)后因素(p= 0.008)和DFS(p= 0.013)在HCC患者中(圖1f)。結(jié)論，WTAP在HCC受到上調(diào)，這與其預(yù)后不良密切相關(guān)。
圖1. 上調(diào)的WTAP表達(dá)與HCC的不良結(jié)果有關(guān)。
二、WTAP促進(jìn)體內(nèi)外腫瘤增殖和致瘤能力
WTAP的敲除和過(guò)表達(dá)分別在Huh7/Hep3B/PLC/PRF/5和SMMC-7721/HCCLM3細(xì)胞中進(jìn)行。CCK-8和菌落形成試驗(yàn)表明，WTAP缺乏抑制所有三種細(xì)胞系的增殖能力，當(dāng)WTAP被過(guò)度表達(dá)時(shí)結(jié)果是相反的(圖2a-c)。EdU試驗(yàn)檢測(cè)到細(xì)胞生長(zhǎng)隨著WTAP敲除而降低(圖2d)。通過(guò)皮下注射HCC細(xì)胞構(gòu)建腫瘤異種移植模型驗(yàn)證WTAP在體內(nèi)的作用，將穩(wěn)定敲除(shWTAP #1、#3)或WTAP過(guò)度表達(dá)(WTAP-OE)的細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)WTAP耗竭抑制腫瘤的發(fā)生(圖2e)，與陰性對(duì)照組相比腫瘤體積和重量顯著降低(圖2f，g)。WTAP的強(qiáng)制表達(dá)在異種移植小鼠中引起相反的表型(圖2h-j)?？傊?，WTAP在HCC發(fā)揮了腫瘤促進(jìn)作用。
圖2 . WTAP在體外和體內(nèi)促進(jìn)HCC細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)。
三、ETS1被確定為WTAP在HCC的潛在目標(biāo)
采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)說(shuō)明WTAP敲除細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化來(lái)驗(yàn)證WTAP在HCC發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用的潛在機(jī)制。分層聚類顯示W(wǎng)TAP缺失后有1636個(gè)上調(diào)基因和794個(gè)下調(diào)基因(圖3a)。參考文獻(xiàn)以建立基因組重疊，Venn 圖共揭示了15個(gè)基因(圖3b)。RT-qPCR評(píng)估了WTAP對(duì)每個(gè)候選人的影響。其中，在WTAP沉默后，et1和et2持續(xù)顯著上調(diào)，當(dāng)WTAP過(guò)度表達(dá)時(shí)，它們均適度下調(diào)(圖3c-e)。WB分析顯示，WTAP的失活顯著導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平上et1的升高，而不是et2的升高(圖3f，g)。該研究進(jìn)一步證明了在Hep3B和HCCLM3細(xì)胞中ETS1的含量相反地受到WTAP的影響(圖3h, i)。因此推測(cè)ETS1的功能障礙可能是WTAP介導(dǎo)的HCC增殖信號(hào)的原因。
圖3. 高通量測(cè)序組合顯示ETS1是WTAP的目標(biāo)。
四、WTAP增加ETS1基因m6A修飾
根據(jù)MeRIP-seq數(shù)據(jù)，ETS1的調(diào)制可能以m6A依賴的方式發(fā)生。采用m6A點(diǎn)印跡法和RNA甲基化定量法測(cè)定陰性對(duì)照組和穩(wěn)定WTAP敲除組中m6A的整體水平，m6A水平隨著兩個(gè)HCC細(xì)胞系中WTAP的缺失而顯著降低(圖4a，b)。MeRIP-qPCR分析確定，與IgG對(duì)照相比m6A特異性抗體強(qiáng)烈富集ETS1轉(zhuǎn)錄物。此外，該研究發(fā)現(xiàn)WTAP沉默后m6A修飾的ETS1數(shù)量顯著減少(圖4c)。用一個(gè)野生型(WT)和兩個(gè)突變型(Mut)質(zhì)粒進(jìn)行熒光素酶報(bào)告分析，對(duì)于Mut報(bào)道預(yù)測(cè)m6A位點(diǎn)中的幾個(gè)腺苷堿基(A)被胞嘧啶堿基(C)取代，以消除m6A甲基化的影響，而WT報(bào)道包含完整的m6A位點(diǎn)(圖4d)。在WTAP敲除下，野生型組的熒光素酶活性適度增強(qiáng)，而野生型組的熒光素酶活性肯定對(duì)WTAP沉默的影響產(chǎn)生了抗性(圖4e)，說(shuō)明ETS1的監(jiān)管受WTAP指導(dǎo)的m6A修改控制。該研究進(jìn)一步證實(shí)WTAP和ETS1的關(guān)聯(lián)可能不在蛋白質(zhì)水平，而是在RNA水平。
五、WTAP以m6A-HuR介導(dǎo)的方式抑制ETS1的表達(dá)
因?yàn)閙6A修飾的轉(zhuǎn)錄物依賴效應(yīng)蛋白在生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮功能，YTHDF2、m6A readers蛋白經(jīng)常參與調(diào)節(jié)基因的降解。HuR的減少顯著減輕了ETS1的表達(dá)(圖4f)。與IgG對(duì)照相比，HuR特異性抗體顯著富集ETS1 mRNA，而抑制WTAP顯著增強(qiáng)ETS1 mRNA的富集，如RIP-qPCR所示(圖4g)。WTAP通過(guò)干擾HuR蛋白和ETS1基因的結(jié)合來(lái)抑制ETS1，而不是改變HuR的表達(dá)。此外，WTAP敲低引起的ETS1的升高可以通過(guò)HuR的衰減來(lái)恢復(fù)(圖4h)。。該研究發(fā)現(xiàn)敲除WTAP可以延長(zhǎng)ETS1RNA的半衰期，而HuR沉默可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)(圖4I)。熒光素酶報(bào)告分析確定了HuR參與m6A修飾，在WT組中WTAP沉默誘導(dǎo)的熒光素酶活性的增強(qiáng)可以被HuR挽救。當(dāng)ETS1的m6A位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，HuR表達(dá)的改變似乎對(duì)熒光素酶活性無(wú)效(圖4j)?？傊?，該研究的發(fā)現(xiàn)表明WTAP通過(guò)m6A-HuR依賴途徑抑制ETS1。
圖4. WTAP以m6A-HuR介導(dǎo)的模式抑制ETS1。
六、ETS1作為腫瘤抑制因子，逆轉(zhuǎn)了WTAP在HCC的作用
29對(duì)HCC標(biāo)本中ETS1在HCC腫瘤及鄰近組織中的表達(dá)，與HCC的癌旁組織相比ETS1在腫瘤組織中的表達(dá)較低(圖5a，b)。此外，該研究發(fā)現(xiàn)基于共鄰體1的IHC染色，鄰近組織中的陽(yáng)性率明顯更高(圖5c，d)。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)，高水平的ETS1意味著更好的預(yù)后5e)。體外功能驗(yàn)證(包括CCK-8和菌落形成)表明，敲除ETS1可增強(qiáng)MHCC97H、HCCLM3和Huh7細(xì)胞的增殖能力(圖5f、g)。此外，ETS1沉默挽救了WTAP敲除對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和生存能力的抑制作用(圖5h，I)。因此，ETS1的失活可能導(dǎo)致HCC通過(guò)WTAP-ETS1軸的進(jìn)展。
圖5. ETS1通過(guò)WTAP介導(dǎo)的表型逆轉(zhuǎn)在HCC發(fā)揮腫瘤抑制作用。
七、WTAP的沉默導(dǎo)致G2/M通過(guò)ETS1-p21/p27軸在HCC被捕
WTAP敲低造成大量G2/M阻滯(圖6a,b)，而過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了G2/M期轉(zhuǎn)變。當(dāng)WTAP在轉(zhuǎn)錄水平失活時(shí)，p21和p27(在細(xì)胞周期和增殖中起重要作用的腫瘤抑制因子)的表達(dá)顯著增加(圖6c,d)。WB驗(yàn)證了WTAP敲除上調(diào)p21和p27，同時(shí)下調(diào)CDC25C、CDK1、細(xì)胞周期蛋白-A2和細(xì)胞周期蛋白-B1(圖6e)。相反，WTAP的過(guò)度表達(dá)減輕了p21和p27的表達(dá)，并降低了G2期所有指示的檢查點(diǎn)蛋白的放大倍數(shù)(圖6e)。由WTAP沉默引起的G2/M阻滯與ETS1的抑制顯著相反(圖6f，g)，ETS1的敲除導(dǎo)致p21和p27的減少，WB分析揭示了相同的結(jié)論(圖6h)。芯片分析表明ETS1可以結(jié)合它們的啟動(dòng)子(圖6I)，說(shuō)明ETS1可以增強(qiáng)p21和p27的轉(zhuǎn)錄。ETS1的抑制恢復(fù)了由WTAP抑制引起的p21和p27的高表達(dá)(圖6j)。這些數(shù)據(jù)表明，ETS1-p21/p27軸對(duì)于HCC依賴WTAP的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)至關(guān)重要。
圖6. WTAP通過(guò)減輕p21和p27的表達(dá)參與細(xì)胞周期。
八、高WTAP和低ETS1表達(dá)的組合預(yù)測(cè)了HCC的不利結(jié)果
為了評(píng)估WTAP和ETS1之間的臨床相關(guān)性，在同一個(gè)來(lái)自cohort1的HCC標(biāo)本中進(jìn)行了WTAP和ETS1染色的IHC分析。WTAP表達(dá)較高的樣本中，近65.2%呈現(xiàn)較弱的ETS1染色，而WTAP表達(dá)較低的樣本中，約55.6%呈現(xiàn)較強(qiáng)的ETS1染色(圖7a，b)。高表達(dá)WTAP或低表達(dá)ETS1與HCC患者預(yù)后不良獨(dú)立相關(guān)(1e、f和5e)。然后Kaplan-Meier 在這兩個(gè)要素結(jié)合的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證明了HCC個(gè)人與WTAPhigh的表達(dá)ETS1low總體存活率比任何其他組都差(P= 0.0002)，特別是與那些在WTAP的人相比lowETS1high(圖7c)。圖解模型(圖7d)說(shuō)明了該研究在WTAP介導(dǎo)的m6A調(diào)控方面的發(fā)現(xiàn)。在臨床樣本中，WTAP和ETS1呈負(fù)相關(guān)，WTAP和ETS1的共表達(dá)模式可能被認(rèn)為是HCC的有效預(yù)后因素。
圖7. 高WTAP表達(dá)與低ETS1表達(dá)相關(guān)，顯示HCC預(yù)后不良。
結(jié)論：
該研究闡明了WTAP和激活的WTAP介導(dǎo)的m6A機(jī)制在人類HCC中的致癌作用。WTAP上調(diào)有助于ETS1的m6A修飾，然后通過(guò)HuR相關(guān)的方式表觀遺傳學(xué)沉默ETS1。該研究的發(fā)現(xiàn)豐富了m6A甲基化在腫瘤特征中的功能價(jià)值，并為探索治療HCC的有效治療策略開(kāi)辟了潛在的途徑。