新技術(shù)—不使用抗體的m6A測(cè)序技術(shù)

   美國(guó)杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Kate D. Meyer取得一項(xiàng)新進(jìn)展。研究人員開發(fā)了一個(gè)名為DART-seq的技術(shù)，該方法能夠不使用抗體來對(duì)全局的m6A修飾進(jìn)行檢測(cè)。相關(guān)論文“DART-seq: an antibody-free method for global m6A detection” 于2019年9月23日在線發(fā)表于《自然—方法學(xué)》, IF= 28.467。
   原理：在DART-seq中，胞苷脫氨酶APOBEC1與m6A結(jié)合的YTH結(jié)構(gòu)域融合。細(xì)胞中APOBEC1-YTH的表達(dá)可在與m6A殘基相鄰的位點(diǎn)誘導(dǎo)C-U脫氨，可使用標(biāo)準(zhǔn)RNA序列檢測(cè)到。 DART-seq可從低至10ng的總RNA中識(shí)別出細(xì)胞中的數(shù)千個(gè)m6A位點(diǎn)，并可隨時(shí)間檢測(cè)細(xì)胞中m6A的積累。此外，研究人員使用長(zhǎng)讀本的DART-seq來深入研究了m6A沿單個(gè)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度的分布。
   研究人員表示，改變甲基化位點(diǎn)附近序列的策略將能夠通過標(biāo)準(zhǔn)RNA-seq檢測(cè)m6A，從而克服了當(dāng)前方法的主要局限性，APOBEC1是一種胞嘧啶脫氨酶，其靶向DNA和RNA以誘導(dǎo)胞嘧啶-尿嘧啶（C-to-U）編輯。盡管最初發(fā)現(xiàn)它具有編輯ApoB mRNA的能力，但是APOBEC1自此被用于基于CRISPR–Cas9的基因組編輯方法中，以在目標(biāo)單鏈DNA位點(diǎn)誘導(dǎo)C-U轉(zhuǎn)換。我們推測(cè)，可以通過將APOBEC1與m6A結(jié)合的YTH域融合并用RNA-seq檢測(cè)隨后的編輯事件，采用類似的策略來編輯RNA中的m6A鄰近胞苷。在這里，我們展示了這種方法的實(shí)用性，可使用轉(zhuǎn)錄組范圍的作圖法以低至10ng的總RNA作為輸入來檢測(cè)細(xì)胞RNA中的m6A位點(diǎn)。我們的策略綜述了基于抗體的甲基化RNA檢測(cè)方法，并提供了對(duì)單個(gè)轉(zhuǎn)錄亞型中m6A殘基聚類的見解。這種方法大大改善了與全局m6A檢測(cè)相關(guān)的時(shí)間和成本，并將能夠在有限的RNA樣品中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組范圍的作圖。
一、制定有針對(duì)性的脫氨策略以檢測(cè)m6A

   開發(fā)用于m6A檢測(cè)的無抗體方法。m6A的首先選用共有序列包含緊接m6A位點(diǎn)的恒定胞苷殘基（Rm6ACH，其中R = A或G； H = A，C或U），作者推測(cè)將APOBEC1募集到m6A位點(diǎn)將使m6A殘基緊接著的胞苷脫氨。為了測(cè)試這一點(diǎn)，我們將APOBEC1與YTHDF2的m6A結(jié)合YTH域融合。然后將APOBEC1-YTH融合蛋白與含有單個(gè)內(nèi)部腺苷的合成RNA孵育。反轉(zhuǎn)錄和Sanger測(cè)序表明在甲基化RNA中緊接m6A后立即對(duì)胞苷進(jìn)行頻繁編輯，而在未甲基化RNA中則不是如此（補(bǔ)充圖1a）。APOBEC1與YTH域融合，以指導(dǎo)在m6A位點(diǎn)附近的胞苷殘基上進(jìn)行C-to-U編輯。DART-seq方法的示意圖。APOBEC1-YTH在細(xì)胞中表達(dá)，分離出總RNA并進(jìn)行RNA測(cè)序。然后檢測(cè)到C到U突變以鑒定m6A的位點(diǎn)。

二、DART-seq可識(shí)別整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中包含m6A的RNA

A:餅狀圖，顯示了表達(dá) APOBEC1-YTH（左）和 APOBEC1-YTHmut（右）的細(xì)胞中不同轉(zhuǎn)錄本區(qū)域中 C-U 編輯位點(diǎn)的分布（每個(gè) n = 3 個(gè)獨(dú)立樣本）。B: Metagene 分析顯示了 DART-seq 檢測(cè)到的 C 到 U 編輯事件分布的密度圖。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。C:在表達(dá) APOBEC1-YTH（n = 39,069）， APOBEC1-YTHmut（n = 21,841）或單獨(dú) APOBEC1 的細(xì)胞中，在 C-U 編輯位點(diǎn)周圍的± 4-nt 區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最豐富的基序（ n = 6,814）。使用累積二項(xiàng)式分布來計(jì)算單個(gè)基序富集的 P 值。 D: DART-seq 數(shù)據(jù)的整合基因組學(xué)查看器（IGV）瀏覽器跟蹤，這些數(shù)據(jù)在 JUN 和 EEF2 mRNA 中表達(dá)所示的構(gòu)建體。在至少 10％的讀數(shù)中發(fā)現(xiàn)的 C 到 U 突變由金色/綠色表示（金色表示 C 位點(diǎn)的豐度，綠色表示每個(gè)位置的 U 位點(diǎn)的豐度；兩個(gè)基因均從負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄） 。由 MeRIP-seq（藍(lán)色軌道）標(biāo)識(shí)的 m6A。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。 E:在 ACTB 位點(diǎn)的 DART-seq 讀取覆蓋率。在至少 10％的讀數(shù)中發(fā)現(xiàn) C 到 U 突變由單個(gè)位點(diǎn)的金色/綠色表示（金黃色表示 C 位點(diǎn)的豐度，綠色表示每個(gè)位置的 U 位點(diǎn)的豐度； ACTB 指從陰性位置轉(zhuǎn)錄）。

三、DART-seq監(jiān)測(cè) m6A 隨時(shí)間的變化情況

A:與未經(jīng)處理的對(duì)照（UT； n = 40,594）相比， DART-seq 在經(jīng) CPT 處理的 HEK293T 細(xì)胞（n =5,689）中發(fā)現(xiàn)的 C 至 U 突變的分布。 ** P <0.0001。 B-C: IGV 瀏覽器圖像顯示了 CPT 處理后 BPTF（b）和 ATRX（c）轉(zhuǎn)錄本的 CDS 中的C 到 U 突變。在至少 10％的讀數(shù)中發(fā)現(xiàn)的 C 到 U 突變由藍(lán)色/紅色（C / U）著色表示BPTF 轉(zhuǎn)錄本（正鏈），以及 ATRX 轉(zhuǎn)錄本（負(fù)鏈）中的金/綠（C / U）著色。 CPT 處理后富集的 C-U 站點(diǎn)由紫色三角形表示。 n = 2 個(gè)獨(dú)立樣本。D: MeRIP-RT-qPCR 證實(shí)了 CPT 處理后 BPTF 和 ATRX mRNA 中 m6A 的富集。E: 使用未經(jīng)處理和經(jīng) CPT 處理的細(xì)胞中的 RNA 進(jìn)行的 RT–qPCR 分析顯示，經(jīng)過 CPT 處理后， BPTF 和 ATRX 轉(zhuǎn)錄本的豐度降低。

四、長(zhǎng)時(shí)間閱讀的 DART-seq 顯示了單個(gè) RNA 分子中的 m6A 分布

   長(zhǎng)時(shí)間閱讀的 DART-seq 顯示了同工型特異性甲基化模式?；诿庖叱恋淼?m6A 檢測(cè)策略先前已報(bào)告了 m6A 位點(diǎn)的聚類 3–5.但是，尚不清楚這是否反映了 m6A 在相同或不同的 RNA 分子上的聚集。由于 DART-seq 誘導(dǎo)單個(gè)轉(zhuǎn)錄本中的編輯事件，因此我們認(rèn)為可以檢查單個(gè)測(cè)序讀數(shù)以確定在同一 RNA 分子中是否存在 m6A 位點(diǎn)。為了對(duì)此進(jìn)行調(diào)查，我們使用 PacBio 平臺(tái)進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間讀取的 DART-seq。單個(gè) mRNA 的檢測(cè)表明，盡管某些轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出同工型特異性區(qū)域編輯，但其他轉(zhuǎn)錄本在5'UTR， CDS 和 3'UTR 中包含 DART-seq 位點(diǎn)。此外，有 41％的讀取至少跨越兩次。