環(huán)狀A(yù)KT3 RNA編碼的蛋白抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的致瘤性

   膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是最致命的腫瘤之一，盡管治療手段多樣，但是GBM患者的中位生存時(shí)間僅為12-14個(gè)月。近日，來(lái)自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer上發(fā)表了一篇題名為：A novel tumor suppressor protein encoded by circular AKT3 RNA inhibits glioblastoma tumorigenicity by competing with active phosphoinositide-dependent Kinase-1的文章。該文章主要講述了circRNA Circ-AKT3編碼的蛋白通過(guò)與活化的PDK1競(jìng)爭(zhēng)來(lái)阻斷AKT thr-308磷酸化，達(dá)到抑制GBM細(xì)胞的增殖，抗輻射性和致瘤性。

一、Circ-AKT3在GBM樣品和細(xì)胞系中低表達(dá)
   對(duì)GBM癌和癌旁組織進(jìn)行circRNA測(cè)序，GBM癌組織中3363個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，3072個(gè)下調(diào)。三個(gè)circRNA-AKT3（hsa_circ_0017250，hsa_circ_0112784和hsa_circ_0112781）在測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，只有hsa_circ_0017250含有完整ORF。腫瘤組中hsa_circ_0017250（circ-AKT3）的水平明顯低于正常組，因此選取circ-AKT3進(jìn)行后續(xù)研究。
  Circ-AKT3由AKT3基因的第3外顯子到第7外顯子生成，全長(zhǎng)524 nt，PCR產(chǎn)物和Sanger測(cè)序證實(shí)了Circ-AKT3圓形結(jié)構(gòu)。與線性形式的AKT3 mRNA相比，CIRC-AKT3在RNA酶作用下具有更長(zhǎng)的半衰期。FISH結(jié)果表明，CIRC-AKT3在星形膠質(zhì)細(xì)胞（NHA）的細(xì)胞質(zhì)中，核質(zhì)分離PCR結(jié)果驗(yàn)證這一結(jié)論。利用Northern印跡檢測(cè)過(guò)表達(dá)的circ-AKT3或加circ-AKT3 shRNA轉(zhuǎn)染的NSC和NHA細(xì)胞中的circ-AKT3的表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR方法在患者組織和細(xì)胞系中驗(yàn)證circ-AKT3和線性AKT3 RNA表達(dá)水平，與NSC和NHA細(xì)胞相比，GBM和GICs細(xì)胞表達(dá)的circ-AKT3水平較低。線性AKT3的mRNA有在GBM細(xì)胞和臨床樣品中低表達(dá)。

二、Circ-AKT3編碼174個(gè)氨基酸（aa）的新蛋白AKT3-174aa
   CIRC-AKT3具有預(yù)測(cè)的ORF，可以通過(guò)使用包含起始和終止密碼子“UAAUGA”的片段編碼174個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。使用雙熒光素酶檢測(cè)CIRC-AKT3的IRES活性，在IRES的驅(qū)動(dòng)下，174個(gè)氨基酸的產(chǎn)物涵蓋了與AKT3蛋白相同的62–232氨基酸序列，并帶有一個(gè)特殊的“Ans Ala Ser”C端。使用的抗體結(jié)合AKT3蛋白的中間部分，抗體可以識(shí)別AKT3和AKT3-174aa。AKT3-174aa在GBM細(xì)胞和組織中低表達(dá)。使用CIRC-AKT3的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，證實(shí)174個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)的蛋白通過(guò)CIRC-AKT3編碼。再低CIRC-AKT3表達(dá)的細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染circ-AKT3和線性化的AKT-174aa質(zhì)粒，均產(chǎn)生了預(yù)測(cè)的AKT-174aa條帶。與此相反，在兩個(gè)shRNA敲低CIRC-AKT3的NHA細(xì)胞中，AKT3-174aa表達(dá)減少，不影響線性AKT3的mRNA編碼的蛋白表達(dá)。SDS-PAGE電泳后使用質(zhì)譜技術(shù)確定了AKT3-174aa肽段的分子量。這些結(jié)果證明，circ-AKT3編碼這種174個(gè)氨基酸的新蛋白，我們稱之為AKT3-174aa。免疫熒光結(jié)果顯示，AKT3-174aa在U251細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中存在。在臨床樣本中，AKT3-174aa表達(dá)與GBM患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，線性AKT3的表達(dá)水平與GBM患者總體存活的物相關(guān)性。這表明AKT3-174aa可以是用于GBM患者的預(yù)后標(biāo)志物

三、AKT3-174aa作為抑制惡性表型的GBM腫瘤抑制劑
   在SW1783和Hs683神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中circ-AKT3的敲低只能減少AKT3-174aa的表達(dá)，而不減少AKT1，AKT2和AKT3的表達(dá)。在U251和U373細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circ-AKT3，只增加現(xiàn)行AKT3-174aa的表達(dá)，并不影響AKT1，AKT2和AKT3的表達(dá)。并且過(guò)表達(dá)circ-AKT3的U251和U373細(xì)胞增殖能力減弱，敲低CIRC-AKT3促進(jìn)SW1783和HS683細(xì)胞生長(zhǎng)。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中AKT3-174aa與細(xì)胞集落形成呈負(fù)相關(guān)。AKT3-174aa過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了GBM細(xì)胞放射敏感性，AKT3-174aa敲低加強(qiáng)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的放射不敏感性。這些數(shù)據(jù)結(jié)果支撐了AKT3-174aa的腫瘤抑制的作用。

四、AKT3-174aa發(fā)揮生物學(xué)功能
   為了進(jìn)一步驗(yàn)證AKT3-174aa而不是circ-AKT3發(fā)揮上述功能，使用線性化AKT3-174aa質(zhì)粒在穩(wěn)定敲除circ-AKT3的SW1783和Hs683細(xì)胞中恢復(fù)AKT3-174aa的表達(dá)。AKT3-174aa的表達(dá)逆轉(zhuǎn)由CIRC-AKT3穩(wěn)定敲除引起的惡性表型。相反，過(guò)表達(dá)起始密碼子突變的CIRC-AKT3，并不能抑制U251和U373細(xì)胞增殖，集落形成和放射不敏感等惡性表型。以上結(jié)果證明AKT3-174aa在GBM中發(fā)揮了腫瘤抑制作用，而不是circ-AKT3。

五、AKT3-174aa抑制AKT Thr308的磷酸化
   為了研究AKT3-174aa參與的分子機(jī)制，對(duì)穩(wěn)定表達(dá)circ-AKT3和circ-AKT3 IRES-mut（突變）質(zhì)粒的U251和U373細(xì)胞進(jìn)行RNA序列分析。在U251和U373中分別檢測(cè)到共1873和2471個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）。DEGs和KEGG分析均顯示出與癌癥相關(guān)途徑的顯著關(guān)聯(lián)，包括PI3K-Akt信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路等。由于AKT3-174aa與AKT3共享一段相同的序列，因此首先檢查了AKT3-174aa過(guò)表達(dá)或敲低細(xì)胞中AKT亞型的激活。AKT3-174aa不影響總AKT1，AKT2或AKT3的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；AKT3-174aa抑制AKT-的Thr308但不抑制AKT-Ser473的磷酸化。
   在人GBM中，AKT激活通常與PTEN交替相關(guān)，在AKT3-174aa過(guò)表達(dá)的U251和U373細(xì)胞和在AKT-174aa穩(wěn)定敲除的SW1783和Hs683細(xì)胞中，未發(fā)現(xiàn)p-EGFR（thr1068）發(fā)生變化。在PTEN野生型SW1783和HS683細(xì)胞中，PTEN表達(dá)也未AKT3-174aa敲低影響。AKT3-174aa的過(guò)表達(dá)減少了AKT2和AKT3的thr-308磷酸化，但沒(méi)有降低ser-473的磷酸化，這表明AKT3-174aa的影響大于AKT3。這些結(jié)果表明AKT3-174aa在p-AKT上游發(fā)揮作用，而不是影響AKT亞型本身。盡管PDK1或p PDK1表達(dá)不受AKT3-174aa的影響，但是通過(guò)使用質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)p PDK1是AKT3-174aa免疫沉淀復(fù)合物的潛在相互作用蛋白。在IP實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)lag標(biāo)記AKT3-174aa可能與p PDK1相互作用。雖然pulldown實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有結(jié)果，但是在體外IP實(shí)驗(yàn)中GST-AKT3-174aa與His-PDK-1可以相互作用，這進(jìn)一步證實(shí)這AKT3-174aa PDK-1互動(dòng)與激活。在熒光雙染中AKT3-174aa 與PDK-1共定位，表明這表明AKT3-174aa通過(guò)與對(duì)p PDK1相互作用以抑制AKT的THR-308。

六、AKT3-174aa是AKT的天然顯性負(fù)調(diào)節(jié)變體
   由于AKT3-174aa與AKT3在62-232位氨基酸共有相同的序列，AKT3-174aa可能與AKT亞型競(jìng)爭(zhēng)與p-PDK1結(jié)合。過(guò)表達(dá)AKT3-174aa后p-PDK1的活性顯著抑制。此外，AKT激酶活性在U251和U373 AKT3-174aa過(guò)表達(dá)細(xì)胞中被抑制，而在SW1783和HS683 AKT3-174aa穩(wěn)定敲低細(xì)胞活性增強(qiáng)。劑量依賴性轉(zhuǎn)染CIRC-AKT3進(jìn)入U(xiǎn)251細(xì)胞，并用AKT2，AKT3和對(duì)PDK1進(jìn)行免疫沉淀。隨著AKT3-174aa的表達(dá)增加，P-Thr308在AKT2和AKT3的IP均降低。在劑量依賴性敲低的SW1783細(xì)胞行中結(jié)果相反。結(jié)果表明，AKT3-174aa是蛋白質(zhì)誘餌，通過(guò)顯性負(fù)調(diào)控限制P-AKT的異?；罨?/span>

七、AKT3-174aa在體內(nèi)抑制GBM致瘤性
   在小鼠顱內(nèi)腫瘤模型中測(cè)試AKT3-174aa的腫瘤抑制作用。AKT3-174aa過(guò)表達(dá)顯著提高小鼠模型的總生存時(shí)間，與之相反敲低AKT3-174aa促進(jìn)體內(nèi)腫瘤形成。在小鼠異種移植腫瘤中，AKT3-174aa過(guò)表達(dá)與p-AKT-thr308的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)；這支持了AKT3-174aa抑制AKT活化誘導(dǎo)的惡性表型?？傊Y(jié)果表明，AKT3-174aa是GBM腫瘤發(fā)生過(guò)程中PI3K / AKT信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)。

結(jié)論：
   Circ-AKT3是新鑒定的AKT3轉(zhuǎn)錄變異體。Circ-AKT3編碼AKT3-174aa，與p-PDK1相互作用。Circ-AKT3和AKT3-174aa在GBM中低水平表達(dá)，可以更容易地誘導(dǎo)AKT-thr308磷酸化和p-PDK1的激活。恢復(fù)AKT3-174aa的表達(dá)可在體外和體內(nèi)抑制GBM的細(xì)胞增殖，存活和致瘤性。作為PI3K / AKT信號(hào)的新型負(fù)調(diào)節(jié)劑，AKT3-174aa是GBM患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物。