m6A甲基轉移酶ZCCHC4介導核糖體RNA甲基化

      RNA修飾幾乎普遍存在于所有細胞RNA中，甲基化是人類最普遍的RNA修飾類型之一。m6A RNA甲基化修飾廣泛存在于人類的mRNA、rRNA、snRNA中。盡管mRNA m6 A修飾在眾多生物系統(tǒng)中起關鍵作用，但對于rRNA的m6A甲基轉移酶和rRNA m6A修飾的功能尚不清楚。近日Nature子刊Nature Chemical Biology發(fā)表了一篇題名為：N6-Methyladenosine methyltransferase ZCCHC4 mediates ribosomal RNA methylation的文章。文章發(fā)現(xiàn)新的m6A甲基轉移酶ZCCHC4，它主要甲基化人類28S rRNA，并且還與一部分mRNA相互作用。ZCCHC4基因敲除可消除28S rRNA中的m6A修飾，減少整體翻譯，并抑制細胞增殖。作者還發(fā)現(xiàn)ZCCHC4蛋白在肝細胞癌腫瘤中過表達，而ZCCHC4敲除顯著降低了異種移植小鼠模型中的腫瘤大小。

一、ZCCHC4是一種m6A甲基轉移酶，在體外將28S rRNA甲基化
   為了確定ZCCHC4在體外是否具有甲基化活性，純化了全長重組ZCCHC4蛋白，并使用野生型（ZCCHC4 WT）和突變體（ZCCHC4 4A）蛋白進行了體外酶促測定催化活性。用三種帶有不同序列的RNA(GGACU, GAACU 和AAACU)探針底物孵育了重組蛋白。使用液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS / MS）監(jiān)測反應。發(fā)現(xiàn)ZCCHC4專門在含AAC序列的探針上安裝了一個甲基基團，但對含GAC-序列的探針未顯示可見的活性，帶有GAACU序列的探針比含AAACU的探針更適合作為底物。WB和免疫熒光結果表明，ZCCHC4存在于細胞質和細胞核中，進一步顯示在核仁中積累。合成了兩個12-mer RNA探針，分別代表m6攜帶18 S和28S rRNA。在將這些探針與純化的ZCCHC4蛋白和輔因子d3-SAM孵育后，通過MALDI質譜檢測到一個新峰，該峰代表具有添加的甲基的28S rRNA探針。當使用具有催化活性的ZCCHC4時，未觀察到這個新峰。當測試18 S rRNA探針時，檢測到明顯較弱的活性。通過LC-MS / MS進一步消化和定量反應產(chǎn)物，結果表明，ZCCHC4的28S rRNA探針的酶活性比18 S rRNA探針的酶活性高約24倍。這些結果表明ZCCHC4可能是28S rRNA的人RNA m6 A甲基轉移酶。

二、ZCCHC4催化細胞中的28S rRNA甲基化
   采用了紫外交聯(lián)和免疫沉淀技術（PAR-CLIP），鑒定ZCCHC4的RNA底物。提取結合ZCCHC4的RNA進行RNA測序，以鑒定細胞中ZCCHC4的RNA底物。結果表明，ZCCHC4的主要結合靶標是28S rRNA，而在28S rRNA上ZCCHC4 PAR-CLIP峰中測序覆蓋率最高的區(qū)域是1854–1913殘基。在60 S大核糖體亞基的三維結構中，殘基1854–1913靠近m6 A 4220殘基。并且28S rRNA中所有與ZCCHC4結合的區(qū)域都緊密相連。與m6 A 4220站點特別接近，支持ZCCHC4結合并甲基化該站點的觀點。
   為了驗證ZCCHC4在28S rRNA上的甲基化活性，使用CRISPR–Cas9敲除了HepG2和HeLa細胞中的ZCCHC4。在人類中，ZCCHC4有兩種同工型，一個長的帶有所有外顯子，一個短的帶有甲基轉移酶結構域。設計了針對外顯子1的不同sgRNA，外顯子1僅影響長同種型（稱為KO1），外顯子4影響了兩個同種型（稱為KO4）或外顯子7缺失了甲基轉移酶結構域（稱為KO7）。使用與包含A4220位點的甲基化區(qū)域互補的特定40核苷酸（nt）生物素標記的DNA寡核苷酸，從不同的KO和WT細胞中提取了28S rRNA。將RNA片段消化成單核苷酸，并通過LC-MS / MS定量m6 A的量。與WT細胞相比，具有靶向外顯子1的sgRNA的細胞仍具有20％的m6 A，這表明短同工型也有助于殘留的m6 A甲基化。相反，具有靶向外顯子4或外顯子7的sgRNA的細胞中，m6 A幾乎消失我們還在體外用重組ZCCHC4蛋白和輔因子d3-SAM孵育了WT和KO細胞的總RNA，然后pulldown包含28S rRNA m6 A4220的片段，消化成單核苷并進行了LC-MS / MS分析測量d3m6 A水平。我們的結果表明，重組ZCCHC4蛋白還在體外在28S rRNA上安裝了m6 A。
   為了確定28S rRNA中m6 A的缺失是否由ZCCHC4的缺失所致，進行了基因拯救實驗。提取來自HepG2細胞的單個RNA種類（28S rRNA，18 S rRNA和mRNA），通過LC-MS / MS測量m6 A的水平。ZCCHC4敲除后，對28S rRNA的m6 A修飾幾乎完全消失，而18 S rRNA或mRNA在KO細胞中未顯示出明顯變化。過表達ZCCHC4 WT可以完全恢復28S rRNA中m6 A的丟失，但通過突變體ZCCHC4（DPPF變?yōu)?/span>AAAA）組蛋白或對照載體組來不能恢復。這些結果表明ZCCHC4是負責人28S rRNA中m6 A4220甲基化的主要甲基轉移酶

三、ZCCHC4影響細胞翻譯
           rRNA的修飾影響核糖體結構，組裝和動力學等方面作用。那么ZCCHC4介導的rRNA甲基化是否與成熟的rRNA水平相關嗎？對從WT和ZCCHC4 KO細胞提取的總RNA進行變性凝膠電泳和qRT-PCR分析，以比較WT和KO細胞中18S和28S rRNA的水平。結果表明，ZCCHC4基因敲除不會顯著改變成熟rRNA的水平。28S rRNA中約55％的A4220殘基被ZCCHC4甲基化，ZCCHC4基本上不會影響rRNA之前的加工。
   為了驗證ZCCHC4是否影響蛋白質翻譯。以兩種方式測量了WT和ZCCHC4 KO細胞之間翻譯活性的差異。首先，使用熒光素酶實驗，結果顯示WT細胞產(chǎn)生的熒光素酶水平高于KO細胞。我們還使用新合成蛋白質的l-高炔丙基甘氨酸衍生代謝標記來測量整體蛋白質合成活性。結果發(fā)現(xiàn)，與WT細胞相比，KO細胞的整體翻譯水平降低了約25％，并且ZCCHC4 KO細胞的整體翻譯活性可以通過轉染WT flag-ZCCHC4質粒而得以恢復。這些結果支持了前期的假設，即ZCCHC4可能通過其28S rRNA m6 A甲基化活性影響整體翻譯。
   為了進一步研究ZCCHC4對翻譯的影響，通過SDG和多核糖體相關mRNA測序對WT和ZCCHC4 KO細胞進行了多核糖體分析。SDG譜圖顯示，與野生型細胞相比，ZCCHC4 KO細胞中與80S單核糖體峰相比的多核糖體數(shù)量顯著減少。多核糖體相關的mRNA測序表明，28S rRNA m6 A修飾的缺失降低了對mRNA群體的翻譯的嚴格控制。GO分析進一步表明，ZCCHC4可能通過與mRNA的一部分結合而影響翻譯。

四、ZCCHC4表達影響癌癥進展
   接下來，觀察ZCCHC4介導的rRNA甲基化是否影響細胞增殖。與WT對照相比，在三個獨立構建的ZCCHC4基因敲除的HepG2細胞系中，細胞增殖顯著降低。KO細胞的增殖減少可被轉染的野生型ZCCHC4質粒拯救。為了進一步研究ZCCHC4在細胞增殖中的作用，觀察ZCCHC4在癌癥中的潛在作用。測量了ZCCHC4蛋白在肝細胞癌腫瘤（HCT）組織中與癌旁組織的表達水平，HCT腫瘤組織中ZCCHC4蛋白過表達。在180例患者的中癌和癌旁組織中IHC測量了ZCCHC4的表達。在180對腫瘤組織中，ZCCHC4表達水平更高有93個（52％），只有6個（3％）降低的ZCCHC4表達水平。從6例患者的癌和癌旁組織中提取了28S rRNA，并通過LC-MS / MS分析了它們的m6 A水平。其中五名患者腫瘤組織28S rRNA中的m6 A水平高于癌旁組織。最后，進行動物實驗驗證ZCCHC4介導的m6 A甲基化與腫瘤進展之間的關系。在裸鼠腫瘤模型中，與WT細胞相比，ZCCHC4 KO細胞腫瘤體積和重量明顯減少。這些結果支持ZCCHC4催化的rRNA甲基化在癌細胞生長和腫瘤進展中的作用。

結論：
   文章發(fā)現(xiàn)了一種新的人類RNA m6 A甲基轉移酶ZCCHC4，它介導了28S rRNA 內AAC的甲基化。ZCCHC4的rRNA甲基化在細胞增殖調節(jié)和腫瘤發(fā)生中起作用。