新的單外泌體表面蛋白檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜外泌體組分精準(zhǔn)分析

   外泌體是細(xì)胞分泌的30-100nm的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡,內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等成分，也是體液中的重要信息物質(zhì)。越來(lái)越多的研究揭示了外泌體在細(xì)胞間通訊中的作用，同時(shí)也對(duì)外泌體作為疾病診斷和治療的分子標(biāo)志物進(jìn)行了探索。但其中仍存在的一個(gè)重要問(wèn)題是如何對(duì)體液中復(fù)雜的外泌體組成進(jìn)行精準(zhǔn)的分析和分類，并從占比極小的疾病相關(guān)外泌體中獲取更準(zhǔn)確的信息。此前，在nature biotechnology雜志上發(fā)表了稱為nano-plasmonic exosome (nPLEX) assay對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了探索[1]。
   在Nature communication雜志最新一期中，研究人員針對(duì)這一問(wèn)題從另一個(gè)角度開(kāi)發(fā)了proximity-dependent barcoding assay (PBA)方法。讓我們一起了解一下吧。

   該方法希望通過(guò)各種外泌體表面蛋白的差異，分析各種外泌體的含量、該方法流程圖如圖一所示。首先篩選得到針對(duì)各種外泌體表面蛋白的高親和力、特異性抗體。然后使用一段特定的寡核苷酸與抗體偶連。在該段序列上，含有標(biāo)記特定抗體（蛋白）的protein Tag序列，即最終測(cè)序結(jié)果中該序列代表某個(gè)外泌體表面含有該蛋白質(zhì)。此外，在protein Tag序列后含有隨機(jī)的8-nt random unique molecular identifier (UMI)序列，稱為molecule Tag。該序列用來(lái)區(qū)分PCR擴(kuò)增后的每一個(gè)特定蛋白質(zhì)分子[2]。該復(fù)合物被稱為PBA probes。與此同時(shí)，作者設(shè)計(jì)了含有標(biāo)記單個(gè)外泌體的complex Tag的環(huán)狀DNA分子，并通過(guò)適當(dāng)?shù)腞oling circle amplification（RCA）獲得約幾百拷貝的RCA產(chǎn)物。即特定complex Tag序列代表某個(gè)外泌體。

                                 圖1 proximity-dependent barcoding assay (PBA)方法流程圖
   待分析的外泌體孵育后與PBA probes后，接種在特定的96孔微量滴定板上。在該捕獲設(shè)備上，已經(jīng)以設(shè)計(jì)好的稀疏的密度偶連了cholera toxin subunit B (CTB)；該蛋白可以結(jié)合外泌體膜上的GM1 gangliosides從而捕獲外泌體。接下來(lái)，將RCA產(chǎn)物加入體系中并使其通過(guò)互補(bǔ)序列與probes結(jié)合。最后通過(guò)PCR擴(kuò)增和建庫(kù)測(cè)序便可讀取所有的外泌體上檢測(cè)蛋白的含量。
 
   對(duì)這一新開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)方法，作者首先檢測(cè)了它的檢測(cè)準(zhǔn)確度。通過(guò)鏈霉素生物學(xué)系統(tǒng)模擬檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，作者使用了四種protein Tag進(jìn)行了測(cè)試。在分開(kāi)孵育和混合孵育后作者檢測(cè)了四種protein Tag極其molecule Tag的比例。檢測(cè)結(jié)果與理論相符。protein Tag檢測(cè)比例與混合比例一致。Molecule Tag數(shù)也與理論比例一致。飽和情況下，鏈霉素與生物素結(jié)合比例為1：4。

                                          圖2 鏈霉素模擬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PBA準(zhǔn)確性
 
  在采用模擬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該方法后，作者使用外泌體標(biāo)志蛋白CD9和CD63抗體對(duì)該方法進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。在tag A-C和tag B-D分別孵育時(shí)，只能檢測(cè)到同時(shí)含A-C和B-D的蛋白標(biāo)記。當(dāng)四種tag標(biāo)記的抗體同時(shí)孵育時(shí)，則各種tag組合均能檢測(cè)到。這說(shuō)明該方法在檢測(cè)外泌體時(shí)同樣適用。

                                           圖3 CD9和CD63檢測(cè)驗(yàn)證PBA準(zhǔn)確性
 
   接下來(lái)作者使用了該方法對(duì)復(fù)雜的混合外泌體進(jìn)行了研究。作者共檢測(cè)了16中細(xì)胞系上清外泌體和2中體液外泌體的混合體系中的38個(gè)已報(bào)道的外泌體蛋白含量。圖4a中熱圖展示了各個(gè)蛋白的含量分布。在使用3個(gè)或三個(gè)以上的蛋白分子數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析后，作者發(fā)現(xiàn)這些蛋白含量差異能在一定程度上區(qū)分不同來(lái)源的外泌體。

                                    圖4 PBA分析18種外泌體混合體系中38個(gè)蛋白質(zhì)的含量差異

   最后，作者比較了混合樣品中K562細(xì)胞、前列腺小體、健康者血清中外泌體蛋白的差異。在圖5a中，作者展示了鑒定的主要在K652或前列腺小體外泌體中存在的蛋白質(zhì)組合。

                               圖 5 K562和前列腺小體外泌體對(duì)比健康血清中外泌體的特異蛋白質(zhì)組合分析
小結(jié)：
   雖然該方法仍存在著一些限制。比如對(duì)抗體親和力、特異性要求高；測(cè)序深度要求很大等。但對(duì)檢測(cè)高異質(zhì)性的外泌體中特定組分的變化和更有效的對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷提供了很好的技術(shù)手段。
參考文獻(xiàn)：
1.Im, H., et al., Label-free detection and molecular profiling of exosomes with a nano-plasmonic sensor. Nat Biotechnol, 2014. 32(5): p. 490-5.
2. Kivioja, T., et al., Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods, 2011. 9(1): p. 72-4.