CircFOXO3促進膠質(zhì)母細胞瘤的進展

   環(huán)狀RNA是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA，被認為可以介導(dǎo)多種類型腫瘤的進展。越來越多的證據(jù)表明環(huán)狀RNA在癌癥中異常表達，并參與腫瘤的發(fā)展，包括增殖、存活和運動。另外環(huán)狀RNA主要作為miRNA海綿，它們通過競爭性結(jié)合miRNA反應(yīng)元件相互溝通和調(diào)節(jié)，進一步調(diào)節(jié)miRNA靶向基因表達，結(jié)合蛋白質(zhì)，編碼蛋白質(zhì)和促進核易位。這些發(fā)現(xiàn)表明，異位表達的環(huán)狀RNA在腫瘤發(fā)生和癌癥進展中起重要作用。雖然已經(jīng)對環(huán)狀RNA在GBM中的作用進行了初步研究，但對環(huán)狀rna在GBM中的臨床意義和作用機制仍未明確。因此，小編通過以下這篇文章，讓大家對circFOXO3在膠質(zhì)母細胞瘤中的作用機制有深刻的了解。

   本研究中，首先，我們通過qRT-PCR分析了GBM和非癌組織中circFOXO3的變化。接下來，我們使用功能損失和功能獲得的方法來評估circFOXO3對GBM細胞增殖和侵襲的影響。最后，我們進行了熒光原位雜交、RNA下拉、雙熒光素酶報告基因和RNA免疫沉淀分析，以確認環(huán)狀FOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p在GBM中的相互作用。并用動物模型驗證了體外實驗結(jié)果。
結(jié)果：
1.人GBM組織中CircFOXO3高表達
   CircFOXO3包含一個外顯子，該外顯子通過反向剪接最終產(chǎn)生一個1435個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本（圖1A，B）。使用擴增引物在GBM細胞中擴增出連接位點上游和下游約100 bp的CircFOXO3 cDNA，并通過Sanger測序進行分析。結(jié)果證實了circFOXO3連接（圖1C）。擴增引物在有或無RNase R處理的cDNA中檢測到環(huán)狀RNA，證明circRNA是真正的環(huán)狀（圖1D）。
   為了研究circFOXO3在GBM中的表達是否變化，我們檢測了48例膠質(zhì)瘤和10例正常對照組中circFOXO3的表達。如圖1E所示，高級別膠質(zhì)瘤（HGG）的circFOXO3明顯高于低級別膠質(zhì)瘤（LGG）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，circFOXO3表達的增加可能與GBM進展密切相關(guān)。接著我們測定了4個GBM細胞（U87-MG、U251-MG、A172和T98G）和人類正常膠質(zhì)細胞（HEBs）中circFOXO3的表達水平。與HEBs相比，GBM細胞中circFOXO3明顯上調(diào)，U251-MG和U87-MG高表達，A172和T98G低表達。因此，U251-MG和U87-MG用于circFOXO3 KD，A172和T98G用于circFOXO3 OE（圖1F）。另外，我們有效地敲除了U87-MG和U251-MG細胞中的circFOXO3（圖1G和1I）。我們還成功構(gòu)建了circFOXO3表達慢病毒和過表達circFOXO3在A172和T98G中的表達（圖1H，I）。這為接下來探索circFOXO3在GBM細胞中的作用奠定了基礎(chǔ)。

2.CircFOXO3在體外促進GBM的發(fā)生和侵襲
   為了驗證circFOXO3的功能，我們進行了細胞實驗。CCK-8實驗表明，circFOXO3 KD可以顯著抑制U87-MG和U251-MG細胞的增殖（圖2A，B）。此外，集落形成實驗表明，circFOXO3 KD可以減少集落數(shù)量（圖2C，E）和體積（圖2F）。然后，我們使用transwell和傷口愈合試驗來分析circFOXO3對GBM細胞侵襲的影響。Transwell實驗表明，circFOXO3 KD細胞的侵襲力明顯減弱（圖2 G-I）。此外，傷口愈合實驗表明，U87-MG和U251-MG的傷口閉合速度比對照組慢（圖2J-L）?？偟膩碚f,這些發(fā)現(xiàn)為circFOXO3 KD在體外抑制GBM細胞的增殖和侵襲提供了證據(jù)，circFOXO3水平的升高對促進GBM細胞的腫瘤發(fā)生和侵襲具有重要作用。

3.CircFOXO3在GBM細胞中充當(dāng)MiR-138-5p和MiR-432-5p的海綿
   環(huán)狀RNA主要位于細胞質(zhì)中，通常作為miRNA海綿來調(diào)控表達和活性。因此，我們首先搜索了circRNADb數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)circFOXO3沒有預(yù)測到任何蛋白特征。第二，FISH分析顯示circFOXO3含量豐富，位于胞質(zhì)中（圖3A）?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，我們探討了circFOXO3是否與miRNAs結(jié)合。
   我們在不同的公共數(shù)據(jù)庫（RegRNA、starBase、miRDB和CircInteractome）和以前的報告中篩選并分析了2種miRNA （miR-138-5p和miR-432-5p）。這些miRNA在膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，且與circFOXO3相關(guān)的特異性miRNA有多個結(jié)合位點。在尋找與circFOXO3結(jié)合的miRNAs時，我們發(fā)現(xiàn)在circFOXO3中miR-138-5p/miR- 432-5p的結(jié)合位點（圖3B）。隨后，我們研究了circFOXO3與GBM細胞中miR-138-5p/ miR-432-5p的相關(guān)性。MiR-138-5p和miR-432-5p表達在circFOXO3 KD后上調(diào)，在circFOXO3 OE后下調(diào)（圖3C，D）。此外，過表達miR-138-5p/miR-432-5p后，circFOXO3水平明顯降低，抑制miR-138-5p/miR-432-5p后，circFOXO3水平升高（圖3E，F）。
   為了驗證circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p之間的直接結(jié)合，我們進行了生物素偶聯(lián)miRNA捕獲和熒光素酶活性測定。生物素標記的miR-138-5p/miR-432-5p及其突變模擬物被設(shè)計用于拉低過表達circFOXO3的T98G細胞中的circFOXO3。與突變體相比，我們發(fā)現(xiàn)野生型miR-138-5p/miR-432-5p中circFOXO3明顯富集（圖3G）。此外，HEK293T細胞共轉(zhuǎn)染miR-138-5p/miR-432-5p模擬物和熒光素酶報告基因。與對照組相比，miR- 138-5p/miR-432-5p轉(zhuǎn)染降低了熒光素酶報告基因的活性。然后，我們對miR-138-5p/miR-432-5p的預(yù)測結(jié)合位點進行突變，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p/miR-432-5p模擬物和對照組的熒光素酶報告基因活性沒有差異（圖3H）。先前研究表明，環(huán)狀RNA與miRNA的結(jié)合是由AGO2介導(dǎo)的。因此，我們在U87-MG中進行了anti-AGO2 RIP實驗，結(jié)果顯示circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p在AGO2中富集（圖3I）。這些結(jié)果表明circFOXO3可以作為miR-138-5p/miR-432-5p的海綿。

4.MiR-138-5p/miR-432-5p通過靶向GBM細胞中的NFAT5而下調(diào)并作為抑癌基因
   考慮到circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p之間的相互作用，我們接下來評估了miR-138-5p/miR-432-5p在GBM中的表達和功能。如圖4A和B所示，HGG中miR-138-5p/miR-432-5p明顯低于正常對照組。此外，CCK-8實驗顯示，miR-138-5p/miR-432-5p表達降低可顯著提高細胞活力（圖4C，D）。此外，transwell實驗表明，miR-138-5p/miR-432-5p抑制劑轉(zhuǎn)染細胞的侵襲能力明顯高于nc轉(zhuǎn)染細胞（圖4E）。
   根據(jù)既往報道，某些GBM致癌基因是miR-138-5p/miR-432-5p的靶標。因此，使用mirDIP數(shù)據(jù)庫在miR-138-5p/miR-432-5p靶標中選擇了14個致癌基因。在這些致癌基因中，有3個（CDK6、NFAT5和SP1）與腫瘤的進展密切相關(guān)。因此，我們改變了miR-138-5p/ miR-432-5p的表達，并檢測了各自靶細胞的水平（圖4F，G）。Western blot分析顯示過表達miR-138-5p或miR-432-5p的細胞中NFAT5表達下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-138-5p或miR-432-5p抑制劑的細胞中NFAT5表達上調(diào)（圖4 G）。此外，GBM中NFAT5 mRNA和蛋白水平較高（圖4H，I）。NFAT5被證明具有miR-138-5p/miR-432-5p的結(jié)合位點（圖4J）。然后，克隆NFAT5的野生型和突變體3個未翻譯區(qū)域序列，分別構(gòu)建報告質(zhì)粒和突變體載體。共轉(zhuǎn)染miR-138-5p/miR-432-5p模擬物和報告質(zhì)粒后，熒光素酶活性顯著降低。相反，miR-138-5p/miR- 432-5p模擬物和突變載體共轉(zhuǎn)染對熒光素酶活性沒有明顯影響（圖4K）。因此，本研究結(jié)果證實NFAT5是miR-138-5p/ miR-432-5p的直接靶點。

5.CircFOXO3可以調(diào)節(jié)MiR-138-5p和MiR- 432-5p靶點
   我們測量了這些靶點在circFOXO3 OE或KD后的表達。結(jié)果表明，當(dāng)circFOXO3過表達時，NFAT5的上調(diào)最為顯著（圖5A，B）。鑒于NFAT5與circFOXO3共享MREs，我們通過相關(guān)性分析和拯救實驗實驗，探討circFOXO3是否通過海綿miR-138-5p/ miR-432-5p調(diào)控NFAT5表達，從而發(fā)揮其致癌作用。相關(guān)分析顯示，circFOXO3與NFAT5呈中度正相關(guān)（圖5C）。此外，circFOXO3與miR-138-5p或miR-432-5p呈中度負相關(guān)（圖5D，E）。
此外，通過共轉(zhuǎn)染circFOXO3 KD和miR-138-5p和/或miR-432-5p抑制劑U87-MG來進行拯救實驗。qRT-PCR和western blot檢測顯示，與circFOXO3 KD組相比，NFAT5 mRNA和蛋白水平在circFOXO3 KD和miR-138-5p/miR- 432-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染的U87-MG細胞中部分升高（圖5F，G）。與circFOXO3 KD組相比，miR- 138-5p/miR-432-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染的U87-MG細胞的增殖能力增強（圖5H）。這些結(jié)果表明，抑制miR-138-5p/miR-432-5p可以部分恢復(fù)circFOXO3 KD誘導(dǎo)的增殖抑制。同樣，circFOXO3 KD也可以部分減弱miR-138-5p/miR-432-5p介導(dǎo)的U87-MG細胞的侵襲的下調(diào)（圖5I）。

6.CircFOXO3的抑制抑制了異種移植體在體內(nèi)的生長
   為了確定circFOXO3在體內(nèi)對GBM進展的影響，我們將circFOXO3 KD或circFOXO3 NC細胞注入麻醉裸小鼠體紋狀體。植入后，少數(shù)動物開始出現(xiàn)發(fā)病跡象，通過MRI對小鼠進行評估以確定顱內(nèi)腫瘤形成。結(jié)果表明，CircFOXO3抑制顯著降低了腫瘤的生長和侵襲。引人注目的是，植入circFOXO3 KD細胞的小鼠中位生存期為56.5天，而對照組100%在37天內(nèi)死亡（圖6A-D）。在circFOXO3 KD組中，NFAT5的表達持續(xù)下降（圖6E，F）?？傊?，這些結(jié)果表明，circFOXO3在體內(nèi)對GBM的進展至關(guān)重要。

總結(jié)：
   我們首次證明circFOXO3在GBM組織中過表達，并作為miR- 138-5p/miR-432-5p海綿通過ceRNA機制調(diào)節(jié)NFAT5的表達，從而在體內(nèi)外促進腫瘤的發(fā)生。我們證明circFOXO3是GBM中一個新潛在的治療靶點。我們的發(fā)現(xiàn)強調(diào)了circRNA和miRNA相互作用在腫瘤發(fā)生中的重要性。