缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體miR-301a的作用機(jī)制

    最近的證據(jù)表明，miRNAs可以被釋放到細(xì)胞外微環(huán)境中，并通過外泌體介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的通訊。今天小編帶大家了解近期發(fā)表于Molecular therapy上的一篇關(guān)于缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體miR-301a通過靶向TCEAL7激活Wnt/β-catenin信號(hào)并促進(jìn)放療抵抗的文章。本研究的目的是鑒定參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）抗放療的外泌體miR-301a（exo-miR-301a），并揭示其可能的機(jī)制。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.exo-miR-301a由缺氧GBM細(xì)胞特異性表達(dá)和分泌
   根據(jù)我們之前的觀察，miR-301a在膠質(zhì)瘤組織中顯著上調(diào)。在此，我們檢測(cè)exo-miR-301a在缺氧人GBM中的功能。HIF-1α表達(dá)作為缺氧生物標(biāo)志物，與miR-301a在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)進(jìn)行比較。HIF-1α水平高的患者miR-301a表達(dá)水平較高（圖1A），血清e(cuò)xo-miR-301a的百分比根據(jù)HIF-1α免疫組化評(píng)分分布（圖1B）。ELISA結(jié)果顯示，GBM細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)是通過增加細(xì)胞核中HIF-1α的水平（圖1C）。從正常或缺氧條件下暴露的GBM細(xì)胞中檢測(cè)含有CD9、CD63、CD81和HSP70的外泌體標(biāo)記物。如圖1D所示，缺氧細(xì)胞中所有外泌體標(biāo)記物的水平均高于常氧細(xì)胞。低氧條件也顯著增加了外泌體中存在的囊泡數(shù)量，這可以通過納米顆粒跟蹤分析檢測(cè)到（圖1E）。為了探討miR-301a表達(dá)增加與HIF-1α之間的關(guān)系，我們觀察了miR-301a和exo-miR-301a在HIF-1α不同狀態(tài)下的水平。缺氧誘導(dǎo)HIF-1α, siRNA干擾后降低（圖1F）。缺氧顯著增加了miR-301a和exo-miR-301a的表達(dá)；同時(shí)，HIF-1α的下調(diào)顯著降低了miR-301a和exo-miR-301a的表達(dá)（圖1G和1H）。綜上所述，我們證明exo-miR-301a是由缺氧GBM細(xì)胞特異性分泌的，與HIF-1α狀態(tài)有關(guān)。

2.來自缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞的exo-miR-301a直接作用于常氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的TCEAL7
   為了探討miR-301a在TCEAL7調(diào)控中的作用，我們檢測(cè)了exo-miR-301a與TCEAL7蛋白在膠質(zhì)瘤患者中的關(guān)系。TCEAL7水平與miR-301a的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖2A）。為了證實(shí)miR-301a與TCEAL7的直接結(jié)合，設(shè)計(jì)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，利用含有野生型(WT)和突變體(MT)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒TCEAL7 3’UTRs與miR-301a結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行。TCEAL7 3‘UTR包含miR-301a的兩個(gè)高度保守的靶位點(diǎn)，第一個(gè)靶位點(diǎn)被證明是結(jié)合位點(diǎn)（圖2B）。如圖2C所示，與TCEAL7- 3’UTR突變組相比，miR-301a在常氧和缺氧條件下均顯著干擾了轉(zhuǎn)染luc -TCEAL7-UTR的細(xì)胞的熒光素酶活性。與熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在常氧和缺氧條件下，轉(zhuǎn)染As-miR-301a導(dǎo)致TCEAL7表達(dá)顯著下降（圖2D）。此外，我們還檢測(cè)了正常培養(yǎng)的GBM細(xì)胞中TCEAL7的表達(dá)。與對(duì)照組和常氧外泌體組相比，缺氧外泌體處理降低了熒光素酶活性（圖2E）。此外，與正常組和對(duì)照組相比，缺氧外泌體處理顯著改變了TCEAL7蛋白水平（圖2F）。通過轉(zhuǎn)染As-miR-301a，可以阻止缺氧衍生的外泌體對(duì)TCEAL7下調(diào)的影響（圖2G）。

 

3.TCEAL7在膠質(zhì)瘤惡性腫瘤中經(jīng)常下調(diào)
   在相似的組織中檢測(cè)到TCEAL7蛋白水平，并隨著惡性腫瘤程度的增加而下調(diào)（圖3A）。采用qPCR技術(shù)分析TCEAL7在膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá)。如圖3B所示，TCEAL7在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)低于正常組織，且隨著病理分級(jí)的升高而降低。生存分析顯示TCEAL7高表達(dá)患者的生存率明顯高于TCEAL7低表達(dá)患者（圖3 C）。與對(duì)照組相比，在TCEAL7載體組中TCEAL7蛋白水平顯著升高（圖3D）。 MTT結(jié)果顯示，經(jīng)TCEAL7處理的細(xì)胞存活率低于陰性對(duì)照組細(xì)胞（圖3E）。克隆實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染TCEAL7載體的細(xì)胞在軟瓊脂上形成的菌落明顯少于對(duì)照組（圖3F）。此外，上調(diào)TCEAL7表達(dá)可顯著降低GBM細(xì)胞侵襲能力（圖3G）。采用Annexin V/propidium iodide（PI）雙染色，TCEAL7載體中凋亡細(xì)胞比例顯著增加（圖3H）。接下來，我們建立了皮下腫瘤U87細(xì)胞株，如圖3I所示，兩組在腫瘤大小的前9天無明顯差異；然而，從第10天開始，與對(duì)照組相比，TCEAL7載體組的異種移植瘤的大小明顯減小。

4.TCEAL7通過與β-catenin結(jié)合負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin轉(zhuǎn)錄通路，而不抑制β-catenin的穩(wěn)定性
   為了研究TCEAL7與Wnt/ β-catenin信號(hào)通路之間的相互作用，我們首先研究了TCEAL7過表達(dá)對(duì)H4細(xì)胞中β-catenin/T細(xì)胞因子（TCF）轉(zhuǎn)錄活性的影響。β-catenin的加入顯著增強(qiáng)了TOP FLASH活性。然而，TCEAL7的過表達(dá)抑制了β-catenin刺激的TOP FLASH報(bào)告基因的活性（圖4A）。另外，通過TOP/FOP reporter構(gòu)建的高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和LN229中檢測(cè)到，TCEAL7的高表達(dá)顯著抑制了Wnt/β-catenin活性（圖4B）。然后我們檢測(cè)TCEAL7是否調(diào)控wnt靶向基因的表達(dá)。結(jié)果表明，在TCEAL7過表達(dá)細(xì)胞中，wnt靶向基因的表達(dá)水平顯著降低（圖4C）。但過表達(dá)TCEAL7并沒有抑制β-catenin蛋白水平（圖4D）。為了進(jìn)一步研究TCEAL7過表達(dá)對(duì)β-catenin穩(wěn)定性的影響，我們進(jìn)行了環(huán)己酰亞胺追蹤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示過表達(dá)TCEAL7的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，β-catenin沒有顯著變化（圖4E）。為了深入了解TCEAL7抑制表面TCF活性的機(jī)制，我們研究了TCEAL7是否與β-catenin發(fā)生物理作用。結(jié)果表明純化后的TCEAL7與GST-β-catenin共沉淀，但不單獨(dú)與GST共沉淀（圖4F）。此外，HA-β-catenin與FLAG-TCEAL7共沉淀（圖4G）。內(nèi)源性β-catenin與內(nèi)源性TCEAL7共沉淀，在U87和LN229細(xì)胞中形成復(fù)合物（圖4H）。最后，當(dāng)我們?cè)黾覶CEAL7在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)，我們檢測(cè)了β-catenin的核易位。免疫熒光圖4I顯示，與空白對(duì)照相比，TCEAL7過表達(dá)阻斷了β-catenin從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的易位。

5.從缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞中提取的exo-miR-301a轉(zhuǎn)移到正常膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，通過靶向TCEAL7增加Wnt/ β-catenin信號(hào)的活性
   為了證實(shí)缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的miR-301a可以通過外泌體轉(zhuǎn)移到正常細(xì)胞中，我們測(cè)量了不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)正常或缺氧處理后分泌的外泌體miR-301a水平。在源自受體缺氧細(xì)胞的外泌體中，成熟miR-301a的細(xì)胞水平升高（圖5A），但未觀察到pri-或pre-miR-301a在外泌體攝取方面的變化（圖5B）。此外，經(jīng)外泌體處理的細(xì)胞中miR-301a的水平?jīng)]有受到RNA聚合酶II抑制劑的顯著影響（圖5C）。我們研究了Wnt/β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，以闡明TCEAL7參與exo-miR-301a介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。圖5D和圖5E顯示，miR-301a模擬轉(zhuǎn)染和缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞源性外泌體暴露顯著增加了Wnt/β-catenin信號(hào)的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性。相反，高水平的TCEAL7降低了miR-301a模擬物或暴露于缺氧外泌體誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin活性。同樣，在缺氧細(xì)胞中抑制TCEAL7可以消除As-miR-301a在TOP-FOP檢測(cè)中的作用。此外，As-miR-301a和TCEAL7載體挽救了缺氧細(xì)胞來源的外泌體對(duì)Wnt/β-catenin活性的影響（圖5F）。

6.miR-301a參與缺氧外泌體共培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏化
   為了探討缺氧的exo-miR-301a水平是否介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏化，我們檢測(cè)了細(xì)胞輻照后的生存能力。結(jié)果表明，缺氧外泌體組與常氧細(xì)胞相比，在輻射誘導(dǎo)的存活率方面無明顯下降，且表現(xiàn)出抗輻射能力。此外，miR-301a下調(diào)或TCEAL7升高顯著增加細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性（圖6A）。此外，與常氧外泌體組相比，缺氧外泌體組在細(xì)胞活力方面不能被進(jìn)一步抑制；然而，當(dāng)轉(zhuǎn)染As-miR-301a或TCEAL7載體時(shí)，情況發(fā)生了逆轉(zhuǎn)（圖6B）。我們進(jìn)一步研究了miR-301a對(duì)輻照后細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明常氧外泌體培養(yǎng)組被4-或8-Gy照射誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞比例明顯高于缺氧外泌體組，另外伴有As- miR -301a或TCEAL7載體時(shí)，凋亡能力得到恢復(fù)（圖6C ）。為了便于體外實(shí)驗(yàn)，利用U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系建立皮下腫瘤，進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-301a在低氧膠質(zhì)瘤耐輻射中的作用。在異種移植瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，缺氧外泌體組中輻射不能顯著降低腫瘤生長(zhǎng)，體外檢測(cè)分析顯示，As-miR-301a或TCEAL7載體增強(qiáng)了腫瘤抑制作用（圖6D）。然后進(jìn)行qPCR檢測(cè)受Wnt/β-catenin通路轉(zhuǎn)錄調(diào)控的mRNA水平。Wnt/β-catenin下游基因在缺氧外泌體條件下被激活；然而，As-miR-301a或TCEAL7可以顯著抑制過表達(dá)（圖6E）。

總結(jié)：
   exo-miR-301a是缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞特征性表達(dá)和分泌的，是Wnt/β-catenin的一個(gè)強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)劑，然后通過靶向抑癌基因TCEAL7降低放療敏感性。這可能為GBM患者的細(xì)胞耐腫瘤治療放療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。