Clockophagy，一種有利于鐵死亡的新型選擇性自噬過程

   鐵死亡是一種由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的非凋亡調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。自噬涉及溶酶體降解途徑，可以促進(jìn)或阻止細(xì)胞死亡。高水平的自噬與鐵死亡有關(guān)，但這種關(guān)系背后的機(jī)制還沒有明確的解釋。而文章“Clockophagy is a novel selective autophagy process favoring ferroptosis”正是針對(duì)此所做的研究，研究揭示了一條由ARNTL的自噬去除開始，最終促進(jìn)鐵死亡誘導(dǎo)新的途徑。

摘要：
文章的作者利用人類癌細(xì)胞株和小鼠腫瘤模型中研究了自噬對(duì)鐵死亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，自噬作用對(duì)核心晝夜節(jié)律蛋白ARNTL的選擇性降解，即“鐘表性吞噬”（clockophagy），對(duì)鐵死亡起關(guān)鍵作用。SQSTM1是負(fù)責(zé)ARNTL自噬降解的貨物受體。ARNTL通過抑制EGLN2的轉(zhuǎn)錄來抑制鐵死亡，從而激活促生存轉(zhuǎn)錄因子HIF1A。阻止ARNTL降解或抑制EGLN2激活的遺傳或藥物干預(yù)減少，而不穩(wěn)定的HIF1a增加，鐵死亡腫瘤細(xì)胞死亡。

一、鐵死亡中ARNTL的選擇性降解
1型鐵死亡激活劑：系統(tǒng)XC?抑制劑，如Erastin，柳氮磺胺吡啶和索拉非尼。
2型鐵死亡激活劑：是Gpx4抑制劑，包括RSL3和FIN56。
   Calu-1(一種人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系)細(xì)胞對(duì)鐵死亡激活劑敏感，而THP1(一種人類急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系)對(duì)它們具有抗性(圖1A)。免疫印跡分析顯示，在Calu-1細(xì)胞中，ARNTL的蛋白表達(dá)被2型激活劑抑制，而1型激活劑不行(圖1B)。2型激活劑也抑制了其他鐵死亡敏感細(xì)胞系——HT1080(人纖維肉瘤細(xì)胞系)和HL-60(人類早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系)中ARNTL蛋白的表達(dá)(圖1C)。鐵死亡抑制劑(去鐵胺，β-巰基乙醇，ferrostatin-1和liproxstatin-1)，在Calu-1和HT1080細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)了RSL3誘導(dǎo)的ARNYL蛋白下調(diào)(圖1D)。以ferrostatin-1和Liproxstatin-1為變量， RSL3和FIN56誘導(dǎo)沒有顯著改變ARNTL的mRNA水平(圖1E)。相反，RSL3和FIN56下調(diào)ARNTL靶向生物鐘基因如PER1和CRY1的mRNA改變(圖1E)。凋亡誘導(dǎo)劑（staurosporine）或壞死性凋亡誘導(dǎo)劑 TCZ[TNF(腫瘤壞死因子)，Z-VADFMK和CHX]不能誘導(dǎo)ARNTL降解(圖1F)。而Z-VAD-FMK(一種泛半胱氨酸酶抑制劑)和necrosulfonamid[一種針對(duì)MLKL(混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣偽激酶)的壞死型凋亡抑制劑]，則分別抑制staurosporine和TZC誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖1G，H)。
這些發(fā)現(xiàn)表明2型鐵死亡激活劑選擇性地誘導(dǎo)ARNTL蛋白降解。

   哺乳動(dòng)物細(xì)胞有兩種細(xì)胞內(nèi)蛋白降解途徑，即泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬。蛋白酶體抑制劑Mg-132未能阻斷RSL3誘導(dǎo)的CALU-1和HT1080細(xì)胞中ARNTL蛋白的降解(圖2A)。作為陽性對(duì)照，MG-132抑制TNF誘導(dǎo)的NFKBIA/IκBα(核因子?B抑制劑?)在THP1細(xì)胞中的降解(圖2B)，這與以前的發(fā)現(xiàn)一致，即TNF誘導(dǎo)的NFKBIA降解是蛋白酶體依賴性的。與MG-132不同，spautin-1(早期自噬抑制劑)和氯喹(晚期自噬抑制劑)可保護(hù)Calu-1和HT1080細(xì)胞免受RSL3誘導(dǎo)的ARNTL蛋白降解(圖2A)。這些發(fā)現(xiàn)表明自噬，而不是蛋白酶體，可能有助于ARNTL蛋白在鐵死亡過程中的降解。
   我們接下來討論了哪個(gè)自噬途徑參與了ARNTL降解的調(diào)節(jié)。ATG5和ATG7是饑餓誘導(dǎo)的自噬小體形成所必需的。ATG5或ATG7的敲除抑制了MAP1LC3B(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β)-I向MAP1LC3B-II(自噬小體形成的標(biāo)志物)的轉(zhuǎn)化，以及對(duì)RSL3作出反應(yīng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中ARNTL的降解(圖2C)。同樣，特異性短發(fā)夾RNA(ShRNAs)對(duì)ATG5或ATG7的敲除抑制了HT1080細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的MAP1LC3B-II產(chǎn)生和ARNTL降解(圖2D)。然而，跨膜核心ATG蛋白Atg9a的敲除未能阻止這些過程(圖2C)，而ATG蛋白從囊泡向自噬體提供膜。因此，ATG5和ATG7，而不是ATG9A，有助于自噬小體的形成和隨后在RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡過程中ARNTL的自噬降解。特定的貨物受體參與選擇性自噬。SQSTM1是一種多功能的貨物受體，參與泛素化底物的自噬降解，包括蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。質(zhì)譜分析確定SQSTM1在正常條件下是ARNTL的相互作用物(圖2E)。免疫沉淀分析表明，在RSL3誘導(dǎo)的而不是Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡中，SQSTM1-ARNTL相互作用增加(圖2F)。相反，在沒有或存在RSL3的情況下，ARNTL未能與其他貨物受體如NBR1(NBR1，自噬貨物受體)，OPTN(Optineurin)，CALCOCO2/NDP52(鈣結(jié)合和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域2)和NCOA4(核受體共激活劑4) 結(jié)合。Sqstm1缺失減少了MEF中RSL3誘導(dǎo)的ARNTL降解(圖2G)。相反，SQSTM1?/?MEFs中Sqstm1互補(bǔ)DNA的表達(dá)恢復(fù)了RSL3誘導(dǎo)的ARNTL降解(圖2G)。shRNA對(duì)Sqstm1(而不是Nbr1，Optn，Ccolco2或Ncoa4)的敲除也阻止了HT1080細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的ARNTL蛋白的降解(而不是MAP1LC3BII表達(dá))(圖2H)。免疫共沉淀分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在沒有或存在RSL3的情況下，SQSTM1的泛素相關(guān)(UBA)結(jié)構(gòu)域是SQSTM1-ARNTL相互作用所必需的(圖S1)。與饑餓誘導(dǎo)的大量自噬中發(fā)生的SQSTM1的下調(diào)不同，在RSL3誘導(dǎo)的選擇性自噬中觀察到SQSTM1的上調(diào)(圖2，F(xiàn)到H)，這表明SQSTM1的變化可能是細(xì)胞類型和環(huán)境特異性的。
   共聚焦顯微鏡分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，RSL3增強(qiáng)了MAP1LC3B、SQSTM1、LAMP2(溶酶體相關(guān)膜蛋白2)和ARNTL之間的共定位，而Erastin不能(圖S2A到C)。此外，氯喹增強(qiáng)RSL3誘導(dǎo)的ARNTL，MAP1LC3B和SQSTM1(而不是LAMP2)之間的共定位(圖S2A到C)。溶酶體組分的Western blot分析證實(shí)RSL3可導(dǎo)致ARNTL的表達(dá)增加，而Erastin不能(圖S2D)?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明SQSTM1是RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡過程中溶酶體中ARNTL自噬降解的直接受體。

三、自噬介導(dǎo)的ARNTL降解促進(jìn)鐵死亡
   我們接下來研究了自噬介導(dǎo)的ARNTL降解對(duì)鐵死亡的影響。首先，ARNTL通過基因轉(zhuǎn)染在鐵死亡敏感細(xì)胞系(Calu-1和HT1080)中過度表達(dá)(圖3A)。ARNTL的過度表達(dá)減少了RSL3-和FIN56誘導(dǎo)的丙二醛(MDA；脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物)的產(chǎn)生(圖3B)和細(xì)胞死亡(圖3C)。雖然ARNTL的基本表達(dá)不受1型激活劑(erastin，柳氮磺胺吡啶和索拉非尼)的影響(圖1B)，但ARNTL的過度表達(dá)抑制了Calu-1和HT1080細(xì)胞中1型激活劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和MDA產(chǎn)生(圖3，B和C)，表明ARNTL表達(dá)閾值對(duì)1型激活劑誘導(dǎo)的鐵死亡有影響。相反，由兩個(gè)不同的shRNAs(圖3d)敲除ARNTL恢復(fù)了THP1細(xì)胞中由1型和2型鐵死亡激活劑誘導(dǎo)的的MDA產(chǎn)生(圖3e)和細(xì)胞死亡(圖3f)，表明ARNTL的耗盡可以克服對(duì)鐵死亡的抗性。
   Gpx4是各種應(yīng)激條件下脂質(zhì)過氧化的中樞負(fù)調(diào)節(jié)因子。先前的研究表明，Gpx4的誘導(dǎo)性敲除導(dǎo)致Pfa1細(xì)胞中的鐵死亡細(xì)胞死亡。類似于RSL3處理(圖2A)，Gpx4的敲除增加了MAP1LC3B-II的產(chǎn)量(圖S3)。我們觀察到gpx4?/? Pfa1細(xì)胞中ARNTL的下調(diào)(圖3G)和細(xì)胞死亡(圖3H)被鐵死亡抑制劑(例如，ferrostatin-1和Liproxstatin-1)或Atg5，Atg7或Sqstm1的敲除逆轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染強(qiáng)制過表達(dá)ARNTL(圖3i)降低了gpx4?/?Pfa1細(xì)胞中MDA產(chǎn)生(圖3j)和細(xì)胞死亡(圖3k)，表明Gpx4耗盡介導(dǎo)的arnt蛋白降解是鐵死亡所必需的。此外，Atg5、Atg7或Sqstm1(而不是Atg9a)的敲除減少了MEF中RSL3和FIN56誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生(圖3L)和的細(xì)胞死亡(圖3M)。Atg5、Atg7或Sqstm1的敲除也減少了RSL3和FIN56誘導(dǎo)的HT1080細(xì)胞中的細(xì)胞死亡(圖3N)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明自噬介導(dǎo)的ARNTL降解通過激活脂質(zhì)過氧化來促進(jìn)鐵死亡。

四、ARNTL介導(dǎo)的EGLN2下調(diào)阻斷鐵死亡
   ARNTL是一種晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子，主要通過在其啟動(dòng)子中結(jié)合E-box基序(CAGCTG或CACGTG)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。真核生物啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(https：//epd.vital-it.ch/index.php)列出了1666個(gè)帶有E-box基序的人類基因。DAVID(注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫；在線工具對(duì)基因簇的基因本體分析進(jìn)一步顯示12個(gè)含有E-box的基因——EGLN2，NNT，DNAJC16 ，CUL5，TXNRD1，MLYCD，GLRX5，SH3BGR，PPARG，PDIA5，DIO2and ERO1B——可能參與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。我們使用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)來確定這些基因是否作為鐵死亡的一部分由ARNTL直接控制。EGLN2 mRNA在對(duì)RSL3作出反應(yīng)的Calu-1和HT1080細(xì)胞中均上調(diào)(圖4A)。相反，ARNTL的過度表達(dá)阻斷了在Calu-1和HT1080細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的EGLN2上調(diào)(圖4A)。編碼其他EGLN家族成員，包括EGLN1和EGLN3的mRNAs在用RSL3處理和/或ARNTL過度表達(dá)后，其豐度沒有經(jīng)歷任何重大變化(圖4A)。因此，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在Calu-1和HT1080細(xì)胞中，ARNTL結(jié)合到EGLN2的啟動(dòng)子(而不是EGLN1和EGLN3)上(圖4B)。報(bào)告基因(Fig，4C)和Western blot(Fig，4D)分析確定，在RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡中，EGLN2被ARNTL抑制。因此，shRNA對(duì)ARNTL的敲除增加了Calu-1和HT1080細(xì)胞中EGLN2的表達(dá)(圖4E)。除了 ARNTL下調(diào)(圖3G)，gpx4?/? Pfa1細(xì)胞中的EGLN2 上調(diào)調(diào)控(圖3G)也被鐵死亡抑制劑(例如， ferrostatin-1 和Liproxstatin-1)或Atg5，Atg7或Sqstm1的敲除逆轉(zhuǎn)，支持自噬調(diào)節(jié)ARNTL和EGLN2表達(dá)以響應(yīng)Gpx4耗盡誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化。
   為了確定EGLN2的上調(diào)是否有助于鐵死亡，我們?cè)贑alu-1和HT1080細(xì)胞中通過shRNA敲除了EGLN2。EGLN2表達(dá)的抑制(圖4F)限制了對(duì)照和ARNTL敲除HT1080細(xì)胞中RSL3誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生(圖4G)和細(xì)胞死亡(圖4H)。相反，轉(zhuǎn)染強(qiáng)制EGLN2過度表達(dá)(圖4I)在對(duì)照和過度表達(dá)ARNTL的HT1080細(xì)胞中都增加了RSL3誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生(圖4J)和細(xì)胞死亡(圖4K)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)支持ARNTL通過下調(diào)EGLN2表達(dá)抑制鐵死亡的假設(shè)。

五、EGLN2介導(dǎo)的HIF1A下調(diào)促進(jìn)鐵死亡
   HIF1A(缺氧誘導(dǎo)因子1亞基α)是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)微環(huán)境中氧可利用性降低的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)。鑒于EGLN2的主要功能是抑制HIF1a的激活，我們?cè)噲D確定HIF1a的表達(dá)是否受ARNTL介導(dǎo)的EGLN2下調(diào)調(diào)控。ARNTL過表達(dá)抑制EGLN2的表達(dá)，而EGLN2又在RSL3處理后的Calu-1和HT1080細(xì)胞中維持HIF1a的表達(dá)(圖4D)。相反，ARNTL敲除促進(jìn)EGLN2表達(dá)，與RSL3處理后Calu-1和HT1080細(xì)胞中HIF1A表達(dá)降低相關(guān)(圖4E)。ARNTL的敲除在基線條件下部分降低了HIF1a表達(dá)(圖4E)，表明其他非ARNTL途徑可能有助于HIF1a基本表達(dá)。通過特異性shRNA(圖5A)或應(yīng)用adaptaquin(圖5B)對(duì)EGLN的遺傳或藥理作用抑制，增加了RSL3處理的Calu-1和HT1080細(xì)胞中HIF1A的表達(dá)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明ARNTL通過下調(diào)EGLN2在RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡中促進(jìn)HIF1aA的表達(dá)。
HIF1a降解是由泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的。正如預(yù)期的那樣，MG-132抑制RSL3誘導(dǎo)的HT1080細(xì)胞中HIF1a下調(diào)，但不能抑制ARNTL下調(diào)和EGLN2上調(diào)(圖S4A)。HIF1A也可以被鐵螯合劑去鐵胺誘導(dǎo)。正如預(yù)期的那樣，去鐵胺在RSL3處理后恢復(fù)了ARNTL和HIF1A蛋白水平，降低了HT1080細(xì)胞中EGLN2的表達(dá)(圖S4B)。與RSL3處理不同(圖S4A和B)，erastin處理不改變EGLN2和HIF1A的表達(dá)(圖S4C)。
我們接下來試圖研究HIF1A在鐵死亡中的作用。HIF1A抑制劑(例如chetomin和KC7F2)的應(yīng)用或HIF1A敲除在EGLN2敲除或ARNTL過表達(dá)的HT1080細(xì)胞中恢復(fù)了RSL3誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生(圖5C)和細(xì)胞死亡(圖5D)。此外，低氧預(yù)處理誘導(dǎo)HIF1A表達(dá)(圖5E)，因?yàn)樗拗屏薘SL3-和FIN56誘導(dǎo)的Calu-1和HT1080細(xì)胞的MDA產(chǎn)生(圖5F)和細(xì)胞死亡(圖5G)。相反，通過缺氧誘導(dǎo)HIF1A激活以響應(yīng)RSL3和FIN56(圖5H)，脂滴的形成--中性脂質(zhì)儲(chǔ)存的細(xì)胞內(nèi)部位--得以恢復(fù)。此外，負(fù)責(zé)脂肪酸攝取和脂質(zhì)儲(chǔ)存的兩個(gè)關(guān)鍵HIF1a靶基因FABP3和FABP7的mRNA表達(dá)通過在RSL3和FIN56處理后在的Calu-1和HT1080細(xì)胞中的HIF1A激活而恢復(fù)(圖5I)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)HIF1A是鐵死亡中的促生存因子，而EGLN2介導(dǎo)的HIF1a下調(diào)促進(jìn)鐵死亡。

六、ARNTL途徑在體內(nèi)調(diào)節(jié)鐵死亡
  為了確定ARNTL途徑是否也調(diào)節(jié)體內(nèi)腫瘤對(duì)鐵死亡激活劑的敏感性，我們皮下接種ARNTL，EGLN2和HIF1A敲除的HT1080細(xì)胞到免疫缺陷小鼠的右側(cè)。從第7天開始，這些小鼠被系統(tǒng)地用(1S，3R)-RSL3，一種代謝穩(wěn)定的RSL3衍生物，適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，治療2周。與對(duì)照shRNA組相比，RSL3治療有效地減小了攜帶ARNTL或HIF1A敲除細(xì)胞的小鼠形成的腫瘤的大小(圖6A)。相反，攜帶EGLN2基因敲除細(xì)胞的小鼠對(duì)RSL3治療有抵抗力。PTGS2(前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2)表達(dá)的qPCR分析表明，ARNTL和HIF1A敲除增加而EGLN2敲除抑制體內(nèi)鐵死亡。PTGS2是體內(nèi)鐵死亡評(píng)估(圖6B)和MDA定量的標(biāo)志(圖6C)。相反，在這些基因缺失的腫瘤中，CASP3 (caspase 3；凋亡標(biāo)記)活性(凋亡標(biāo)記)沒有被RSL3改變(圖6D)。值得注意的是，在RSL3治療后，ARNTL和HIF1A敲除HT1080腫瘤中脂肪滴的形成(圖6e)及FABP3(圖6f)和FABP7(圖6g)的mRNA表達(dá)降低。相反，它們?cè)贓GLN2敲除HT1080細(xì)胞中基本上沒有受到影響(圖6，E到G)。
  Spautin-1(自噬抑制劑)，adaptaquin(EGLN2抑制劑)和Liproxstatin-1(鐵死亡抑制劑)阻斷RSL3介導(dǎo)的腫瘤生長抑制(圖S5A)，一種與PTGS2 mRNA表達(dá)降低相關(guān)的效應(yīng)(圖S5B)，和MDA產(chǎn)生(圖S5C)。相反，HIF1A抑制劑chetomin增強(qiáng)了RSL3的抗癌活性(圖S5A)，Ptgs2 mRNA表達(dá)(圖S5B)和MDA產(chǎn)生(圖S5C)，而不影響CASP3活性(圖S5D)。同時(shí)，脂滴形成(圖2S5E)、FABP3(圖5S5F)和FABP7(圖S5G)mRNAs的豐度被chetomin降低，與觀察到的這些參數(shù)響應(yīng)于spautin-1、adaptaquin和liproxstatin-1而增加的情況形成對(duì)比?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明ARNTL在體內(nèi)拮抗RSL3介導(dǎo)的鐵死亡的抗癌活性。