lncRNA EMS 將c-Myc和細(xì)胞周期調(diào)控以及腫瘤發(fā)生聯(lián)系在一起

導(dǎo)語：
c-Myc的表達(dá)失調(diào)是癌癥的重要分子標(biāo)志。 c-Myc的致癌功能很大程度上歸因于其作為主要轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)在本質(zhì)。 在這里，將報(bào)告一種長鏈非編碼RNA（lncRNA）E2F1信使RNA（mRNA）穩(wěn)定因子（EMS）作為c-Myc的直接轉(zhuǎn)錄目標(biāo)。 EMS通過促進(jìn)G1 / S細(xì)胞周期進(jìn)程而充當(dāng)致癌分子。 從機(jī)理上講，EMS與RNA結(jié)合蛋白RALY協(xié)同作用來穩(wěn)定E2F1 mRNA，從而增加E2F1的表達(dá)。此外，EMS能夠通過調(diào)節(jié)E2F1 mRNA的穩(wěn)定性將c-Myc連接到細(xì)胞周期控制和腫瘤發(fā)生。 總而言之，這些發(fā)現(xiàn)揭示了一種未發(fā)現(xiàn)的機(jī)制，即c-Myc誘導(dǎo)E2F1表達(dá)的機(jī)制，也暗示EMS是調(diào)節(jié)c-Myc功能的重要參與者。

技術(shù)路線：
1、使用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫分析找出具有致癌功能的c-Myc反應(yīng)性lncRNA
2、通過實(shí)時(shí)RT-PCR或Western印跡分析驗(yàn)證了成功的慢病毒介導(dǎo)的敲低和過表達(dá)。
3、ASO的轉(zhuǎn)染，實(shí)時(shí)RT-PCR，5′ RACE and 3′ RACE. 5
4、RNA原位雜交確定EMS，RNA在細(xì)胞中的分布
5、合成EMS及其反義RNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄
6、生物素下拉檢查EMS和RALY裂解物之間的相互作用
7、ChIP分析、異種移植小鼠模型、

研究結(jié)果：1.EMS通過促進(jìn)G / S細(xì)胞周期進(jìn)程而充當(dāng)致癌lncRNA使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析, ENCODE c-Myc染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）數(shù)據(jù)集的分析表明EMS為分子大小為1,098 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本，主要位于細(xì)胞質(zhì)中。數(shù)據(jù)表明EMS促進(jìn)細(xì)胞增殖。確定了EMS促進(jìn)細(xì)胞增殖并評(píng)估了EMS對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。后面證明了EMS通過加速G1 / S細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)細(xì)胞增殖。再進(jìn)行了軟瓊脂菌落形成試驗(yàn)、異種移植小鼠模型，顯示出EMS基因敲低可強(qiáng)烈抑制A549細(xì)胞的體內(nèi)異種移植腫瘤生長。TCGA數(shù)據(jù)庫的分析，LUAD，LUSC，COAD和乳腺浸潤性癌（BRCA）中的EMS表達(dá)水平升高。此外，腫瘤細(xì)胞系A549，PC9和H1299具有更高的EMS拷貝數(shù)。

2 .EMS是c-Myc的直接轉(zhuǎn)錄目標(biāo)
通過RNA測(cè)序分析，EMS被鑒定為c-Myc反應(yīng)性lncRNA。證明c-Myc的誘導(dǎo)增加，而c-Myc的敲低減少，A549，PC9，H1299，HCT116和MCF7細(xì)胞中的EMS表達(dá)，表明c-Myc對(duì)EMS表達(dá)的特異性作用。根據(jù)c-Myc和EMS細(xì)胞表達(dá)之間的關(guān)系，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的分析表明，c-Myc和EMS的表達(dá)水平在LUAD，LUSC，COAD和BRCA中呈正相關(guān)。接下來，使用JASPAR數(shù)據(jù)庫檢查EMS基因的上游和內(nèi)含子區(qū)域（43）。確定了三個(gè)推定的c-Myc結(jié)合位點(diǎn)（D1，D2和D3。此外，對(duì)ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)集的分析表明，在EMS的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍存在c-Myc和活性組蛋白標(biāo)記H3K4me3。 ChIP分析驗(yàn)證了c-Myc與包含D2位點(diǎn)的染色質(zhì)片段的相互作用。使用了基于pGL3的熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建表明EMS受c-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

3.MS通過增加E2F1表達(dá)發(fā)揮其致癌作用
EMS的敲低或過表達(dá)均未顯示影響IFT22和lncPRESS1的表達(dá)水平?；虮磉_(dá)譜分析。敲出EMS導(dǎo)致987個(gè)基因的差異表達(dá)?；蚣患治霰砻?， E2F目標(biāo)顯著富集。EMS對(duì)E2F1通路產(chǎn)生積極影響，對(duì)EMS過表達(dá)和敲低細(xì)胞中E2F1及其靶基因mRNA表達(dá)的積極影響。另外，EMS的異位表達(dá)增加，而EMS的敲低降低了E2F1的蛋白質(zhì)水平。TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，EMS和E2F1的表達(dá)水平在LUAD，LUSC，COAD和BRCA中呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，EMS能夠積極調(diào)節(jié)E2F1表達(dá)。EMS加速了G1 / S細(xì)胞周期的進(jìn)展。通過使用異種移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)EMS促進(jìn)了裸鼠的異種移植腫瘤生長。通過E2F1誘導(dǎo)可以極大地恢復(fù)EMS抑制性抑制異種移植瘤的生長。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明EMS通過增加E2F1表達(dá)發(fā)揮其致癌作用。

4.EMS與RALY合作提高E2F1 mRNA的穩(wěn)定性
用actinomycinD處理具有擊倒或EMS過度表達(dá)的A549細(xì)胞不同時(shí)間，以測(cè)量E2F1 mRNA的衰減。擊倒EMS會(huì)導(dǎo)致E2F1 mRNA的半衰期減少，而EMS的過表達(dá)會(huì)延長E2F1 mRNA的半衰期，表明EMS可以穩(wěn)定E2F1 mRNA。lncRNA H19確實(shí)存在于Ago2免疫沉淀物中。與H19不同，EMS沒有富含Ago2免疫沉淀物。對(duì)EMS序列的分析表明，EMS包含具有22個(gè)尿苷的聚U區(qū)段，表明RALY也可能與EMS相互作用。進(jìn)RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，EMS確實(shí)富集了Flag-RALY免疫沉淀。通過生物素下拉測(cè)定法也驗(yàn)證了RALY-EMS的相互作用。此外，體外結(jié)合試驗(yàn)表明，RALY與EMS直接相互作用，但不與它的反義RNA相互作用。證明RALY是EMS的交互合作伙伴，RALY-EMS的相互作用，RALY與EMS直接相互作用，但不與它的反義RNA相互作用。與野生型EMS相比，缺失22個(gè)尿苷的突變EMS（EMS-ΔpolyU）顯示出與RALY的結(jié)合減少，證明RALY是EMS的交互合作伙伴。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明EMS與RALY合作以促進(jìn)E2F1 mRNA的穩(wěn)定性。

5. EMS通過RALY調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長
評(píng)估EMS是否通過RALY調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長。RALY的敲除作用大大降低，而RALY的過表達(dá)則顯著增加，細(xì)胞增殖，Edu陽性細(xì)胞數(shù)量和錨定依賴性細(xì)胞生長。EMS通過RALY促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長。EMS敲除對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用包括：異位表達(dá)的RALY可以大大逆轉(zhuǎn)Edu陽性細(xì)胞的數(shù)量，以及與錨定無關(guān)的細(xì)胞的生長。接下來，證明 EMS的異位表達(dá)顯示可加速G1 / S細(xì)胞周期的敲低細(xì)胞。此外，EMS敲低抑制的G1 / S細(xì)胞周期進(jìn)程被RALY過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)表明EMS通過RALY調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長。

6. EMS將c-Myc連接到細(xì)胞周期控制和腫瘤發(fā)生
通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明c-Myc 通過促進(jìn)EMS介導(dǎo)的E2F1 mRNA穩(wěn)定來調(diào)節(jié)E2F1表達(dá)。c-Myc的異位表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞增殖，并增加了對(duì)照細(xì)胞中的正向陽性細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞周期分布的分析表明，c-Myc加速的G1 / S細(xì)胞周期進(jìn)程可以通過同時(shí)進(jìn)行的EMS抑制來逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，c-Myc可通過促進(jìn)EMS介導(dǎo)的G1 / S細(xì)胞周期進(jìn)程來增加腫瘤細(xì)胞的生長。通過進(jìn)行軟瓊脂菌落形成試驗(yàn)，顯示c-Myc的異位表達(dá)僅能促進(jìn)對(duì)照細(xì)胞中錨定非依賴性細(xì)胞的生長，而不能促進(jìn)EMS抑制細(xì)胞的生長。通過使用異種移植小鼠模型，A549細(xì)胞中異位表達(dá)的c-Myc有望顯著提高異種移植腫瘤的生長。表明c-Myc可能通過EMS促進(jìn)了腫瘤的生長。通過EMS抑制可將c-Myc對(duì)異種移植瘤生長的促進(jìn)作用最小化。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，EMS通過調(diào)節(jié)E2F1 mRNA的穩(wěn)定性將c-Myc連接到細(xì)胞周期控制和腫瘤發(fā)生。
總結(jié) ：
作為最重要的癌基因之一，c-Myc在一半以上的人類癌癥中被激活。 c-Myc的致癌功能很大程度上歸因于其作為主要轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)在本質(zhì)。長非編碼RNA（lncRNA）的失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥。 然而，lncRNA在調(diào)節(jié)c-Myc致癌活性中的功能中具有重要作用。作者發(fā)現(xiàn)作為c-Myc的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，lncRNA E2F1信使RNA（mRNA）穩(wěn)定因子通過調(diào)節(jié)E2F1 mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)c-Myc功能。這項(xiàng)研究提供了有關(guān)c-Myc促進(jìn)腫瘤發(fā)生機(jī)制的見解。