BICD1在低氧適應(yīng)過(guò)程中介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞中的HIF1α核易位

   缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）是導(dǎo)致代謝適應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，這是維持缺氧條件下干細(xì)胞存活的重要生理過(guò)程。然而，人們對(duì)HIF1α如何在缺氧條件下如何進(jìn)入干細(xì)胞的核內(nèi)了解甚少。近期，來(lái)自首爾大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Cell Death Differentitation期刊報(bào)道了BICD1在動(dòng)力蛋白介導(dǎo)的HIF1α核轉(zhuǎn)位中的作用以及BICD1調(diào)節(jié)對(duì)低氧適應(yīng)的影響。文章題目為BICD1 mediates HIF1α nuclear translocation in mesenchymal stem cells during hypoxia adaptation。文章證明了BICD1誘導(dǎo)的HIF1α核易位對(duì)于缺氧適應(yīng)至關(guān)重要，這決定了人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（UCB-MSC）的再生潛力。

1.缺氧刺激的HIF1α核易位依賴于BICD1
   作者研究了低氧條件下UCB-MSCs中HIF1α的核易位中微管和胞質(zhì)動(dòng)力蛋白的作用。數(shù)據(jù)顯示，缺氧誘導(dǎo)的HIF1α核易位被Nocodazole和ciliobrevin D預(yù)處理抑制。并且，與單獨(dú)的低氧治療相比，低氧的ciliobrevin D預(yù)處理增加了裂解的caspase-9蛋白表達(dá)和膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。這些結(jié)果表明，低氧誘導(dǎo)的HIF1α核易位依賴于微管穩(wěn)定性和胞質(zhì)動(dòng)力蛋白的活性，這對(duì)于低氧條件下UCB-MSC的存活至關(guān)重要。接下來(lái)，發(fā)現(xiàn)缺氧刺激了HIF1α與BICD1，BICD2，Dynein IC和α-Tubulin的結(jié)合。同時(shí)，ciliobrevin D預(yù)處理不影響α-微管蛋白與BICD1和BICD2的結(jié)合。siRNA轉(zhuǎn)染BICD1而不抑制BICD2抑制了HIF1α核轉(zhuǎn)運(yùn)和活性。而且，通過(guò)pcDNA3.1 / BICD1-cEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)一步降低了缺氧誘導(dǎo)的HIF1α核易位和活性。為了檢測(cè)HIF1α的脯氨酸羥基化形式（Hyp402和Hyp564），在常氧或低氧條件下將MG132處理為UCB-MSC，結(jié)果表明，BICD1沉默或過(guò)表達(dá)不會(huì)影響低氧降低的HIF1α水平的Hyp402和Hyp564。非MSC細(xì)胞模型研究了BICD1或BICD2沉默對(duì)SK-N-MC神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中HIF1α核易位的影響。缺氧增加了BICD1和BICD2與SK-N-MC中HIF1α的結(jié)合。在低氧治療的實(shí)驗(yàn)組中，BICD1和BICD2 siRNA共轉(zhuǎn)染的SK-N-MC中的HIF1α核水平最低。BICD2沉默顯著抑制了缺氧誘導(dǎo)的BICD1 KO SK-N-MC細(xì)胞系中的HIF1α核易位。這些結(jié)果表明，BICD1和BICD2都具有介導(dǎo)缺氧條件下SK-N-MCs中HIF1α核易位的能力。

2.低氧刺激BICD1和HIF1α之間的相互作用是將HIF1α募集到動(dòng)力蛋白所必需的
   接下來(lái)，作者確定了缺氧對(duì)HIF1α和BICD1之間相互作用的影響。結(jié)果表明，低氧刺激了BICD1與HIF1α，Importinα3和RanBP2的結(jié)合。缺氧顯著增加了HIF1α與BICD1在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的共定位，這也與對(duì)照組相比通過(guò)HIF1α/ BICD1鄰近結(jié)扎測(cè)定（PLA）信號(hào)得以顯示。因?yàn)槿毖跽T導(dǎo)的HIF1α蛋白水平可能有助于HIF1α與BICD1的相互作用，所以用蛋白酶體抑制劑MG132進(jìn)行了預(yù)處理，以抑制缺氧引起的HIF1α蛋白水平的進(jìn)一步誘導(dǎo)。在MG132預(yù)處理?xiàng)l件下，低氧刺激HIF1α與BICD1的結(jié)合，盡管在有氧或無(wú)氧的UCB-MSC中總HIF1α蛋白水平相似。因?yàn)槿毖跽T導(dǎo)的HIF1α蛋白水平可能有助于HIF1α與BICD1的相互作用，所以我們用蛋白酶體抑制劑MG132進(jìn)行了預(yù)處理，以抑制缺氧引起的HIF1α蛋白水平的進(jìn)一步誘導(dǎo)。在MG132預(yù)處理?xiàng)l件下，低氧刺激HIF1α與BICD1的結(jié)合，盡管在有氧或無(wú)氧的UCB-MSC中總HIF1α蛋白水平相似。此外，BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染抑制了缺氧誘導(dǎo)的HIF1α與Dynein IC的結(jié)合。HIF1α/動(dòng)力蛋白IC的缺氧誘導(dǎo)的PLA信號(hào)由被顯著廢除BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染。此外，CoCl 2處理誘導(dǎo)了HIF1α與Dynein IC的結(jié)合和HIF1α核易位，這被BICD1沉默所消除。

3.AKT失活GSK3β增加BICD1和HIF1α的相互作用，導(dǎo)致缺氧下HIF1α核易位
   實(shí)驗(yàn)研究了BICD1如何刺激缺氧誘導(dǎo)的HIF1α核易位的機(jī)制。數(shù)據(jù)表明，缺氧抑制了BICD1與Akt和GSK3β的結(jié)合。然而，在常氧和低氧之間，未觀察到BICD1，BICD2，DYNC1H1和DYNC2H1的mRNA表達(dá)水平的差異，這表明由低氧調(diào)節(jié)的BICD1與其蛋白水平無(wú)關(guān)。PI3K / Akt抑制劑渥曼青霉素的預(yù)處理可抑制低氧刺激的BICD1與HIF1α的結(jié)合以及HIF1α的核易位。此外，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因測(cè)定結(jié)果還表明，Akt抑制劑預(yù)處理抑制了缺氧增加的HIF1活性。相反，用Akt激活劑SC-79進(jìn)行的預(yù)處理顯著增強(qiáng)了缺氧刺激的HIF1α核易位。用Akt抑制劑進(jìn)行的預(yù)處理減少了缺氧誘導(dǎo)的Ser9殘基上GSK3β的抑制性磷酸化，表明缺氧可通過(guò)Akt使GSK3β失活。因此，進(jìn)一步研究GSK3β沉默對(duì)低氧誘導(dǎo)的BICD1和HIF1α之間相互作用的影響。GSK3β siRNA轉(zhuǎn)染廢除BICD1的低氧刺激的結(jié)合HIF1α。此外，與低氧的非靶向（NT）siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC相比，在缺氧的 GSK3βsiRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC中HIF1α核易位和活性增加。而且，與經(jīng)常氧的NT siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC相比，常氧的GSK3βsiRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC刺激了HIF1α核易位和活性。

4.BICD1沉默誘導(dǎo)糖酵解開關(guān)抑制和線粒體ROS積累，導(dǎo)致線粒體損傷
   實(shí)驗(yàn)研究了BICD1調(diào)節(jié)對(duì)UCB-MSCs中糖酵解和細(xì)胞內(nèi)ROS積累的影響。數(shù)據(jù)顯示，低氧增加了HIF1靶向的糖酵解酶（包括HK1，LDHA和G6PD）的mRNA表達(dá)水平，而BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染抑制了其他HIF1靶基因（包括EPO和BNIP3）；然而，它們通過(guò)GSK3βsiRNA轉(zhuǎn)染得到增強(qiáng)。通過(guò)轉(zhuǎn)染BICD1 siRNA 消除了缺氧刺激的己糖激酶活性和乳酸的產(chǎn)生，而BICD2 siRNA則沒有消除。NHE1 mRNA表達(dá)和BCECF-AM的熒光強(qiáng)度被廢除BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染; 然而，它們通過(guò)GSK3βsiRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)一步增加。缺氧的NT siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC的總和線粒體ROS水平高于缺氧的BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC。在缺氧條件下， BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染降低了UCB-MSC的線粒體膜電位。OCR數(shù)據(jù)顯示，低氧會(huì)降低基礎(chǔ)呼吸，最大呼吸和備用呼吸能力。BICD1沉默進(jìn)一步降低了最大呼吸和備用呼吸能力。此外，ECAR數(shù)據(jù)顯示，低氧增加了糖酵解和糖酵解能力，被 BICD1沉默所抑制。這些數(shù)據(jù)表明，BICD1在缺氧刺激的UCB-MSC糖酵解重編程中起著重要作用。

5.缺氧調(diào)節(jié)的BICD1對(duì)于UCB-MSC的存活很重要
   細(xì)胞增殖和活力測(cè)定數(shù)據(jù)表明，在缺氧的48–72小時(shí)內(nèi)，BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC 的增殖和活力顯著低于NT siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC。活細(xì)胞成像結(jié)果表明，在缺氧條件下，BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC在30-72 h內(nèi)的PI陽(yáng)性細(xì)胞顯著高于在NT siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC在缺氧的情況下。此外，在缺氧條件下，NT siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC中的PI陽(yáng)性細(xì)胞和在常氧下，在54–72 h內(nèi)，BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC高于常氧下NT siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC。BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染增加了常氧和低氧的UCB-MSC中裂解的caspase-9和-3的表達(dá)。缺氧的BICD1 siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC 的凋亡明顯高于缺氧的NT siRNA轉(zhuǎn)染的UCB-MSC 的凋亡。此外，BICD1的過(guò)表達(dá)增加了缺氧條件下UCB-MSC的存活率，這完全被HIF1α沉默所消除。

6.GSK3β沉默對(duì)BICD1的調(diào)節(jié)增強(qiáng)了缺氧預(yù)處理的UCB-MSC的再生潛力
   在7天和10天的皮膚傷口手術(shù)后，在給出的缺氧預(yù)處理UCB-MSC的小鼠的傷口面積BICD1的siRNA比給出的缺氧預(yù)處理UCB-MSC的與NT的siRNA小鼠更大。缺氧預(yù)處理的UCB-MSC或帶有NT siRNA的UCB-MSC的傷口愈合效果通過(guò)GSK3βsiRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)一步增強(qiáng)。在皮膚傷口手術(shù)后第10天用haematine和曙紅染色的皮膚樣品進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估時(shí)，缺氧預(yù)處理的UCB-MSC的再上皮組織學(xué)評(píng)分高于含BICD1 siRNA 的缺氧預(yù)處理的UCB-MSC，但較低。比低氧預(yù)處理的UCB-MSC的GSK3βsiRNA。在所有實(shí)驗(yàn)組中，缺氧預(yù)處理的含GSK3βsiRNA的 UCB-MSC的組織學(xué)評(píng)分最高。此外，還評(píng)估是否BICD1或GSK3β siRNA轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)在傷口愈合過(guò)程中誘導(dǎo)MSCs移植新生血管形成。給予缺氧預(yù)處理的UCB-MSC和NT siRNA的小鼠傷口部位的血管分布強(qiáng)度和泛內(nèi)皮標(biāo)記CD31陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著高于低氧預(yù)處理的UCB-MSC的BICD1 siRNA和比缺氧預(yù)處理UCB-MSC的具有較低GSK3β的siRNA。成肌纖維細(xì)胞標(biāo)記物的量α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和人核抗原（HNA），用于移植的UCB-MSC的一個(gè)標(biāo)記，在傷口部位陽(yáng)性細(xì)胞具有給出的缺氧預(yù)處理UCB在小鼠中類似的模式-MSCs與NT，BICD1或GSK3β的siRNA。

結(jié)論:
   實(shí)驗(yàn)證明了缺氧刺激BICD1和HIF1α之間的相互作用，導(dǎo)致BICD1通過(guò)Akt /GSK3β途徑介導(dǎo)的HIF1α核易位。通過(guò)GSK3β抑制作用激活BICD1增強(qiáng)了缺氧適應(yīng)糖酵解的能力和UCB-MSC的存活，從而導(dǎo)致缺氧預(yù)處理移植的UCB-MSC的再生潛力增加。作者的研究是對(duì)BICD1作為導(dǎo)致缺氧適應(yīng)的HIF1α核易位的調(diào)節(jié)因子的首次鑒定。盡管需要進(jìn)一步研究HIF1α與BICD1相互作用的結(jié)合序列以找到其他BICD1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，但研究為基于MSC的治療提供了HIF1α特異性治療策略的新見識(shí)。