人18S rRNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶新發(fā)現(xiàn)——METTL5

   RNA甲基化在mRNA上被大量發(fā)現(xiàn)，rRNA甲基化修飾卻研究的很少，并且rRNA甲基化修飾作用仍不清楚。近日，來(lái)自法國(guó)巴黎理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在Nucleic Acids Research期刊上發(fā)表題名為：The human 18S rRNA m6A methyltransferase METTL5 is stabilized by TRMT112的研究文章。該文章主要發(fā)現(xiàn)METTL5一個(gè)是負(fù)責(zé)18S rRNA m6A修飾的酶，并確認(rèn)ZCCHC4為28S rRNAm6A修飾酶；METTL5必須與已知的甲基轉(zhuǎn)移酶激活劑TRMT112形成異源二聚體復(fù)合物，以在細(xì)胞中獲得代謝穩(wěn)定性。文章還提供了METTL5-TRMT112的第一個(gè)原子分辨率結(jié)構(gòu)。

1.鑒定m6A1832和m6A4220上沉積的18S和28S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶
   為了鑒定在18S rRNA的A 1832和28S rRNA的A 4220處沉積m 6 A 的甲基轉(zhuǎn)移酶，在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索了具有N6-腺苷特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。檢索到七個(gè)結(jié)果結(jié)果：HEMK1、HEMK2、TRMT11、MGAM2、METTL4、METTL5和ZCCHC4。根據(jù)人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜計(jì)劃，METTL4是人類(lèi)U2-OS細(xì)胞中線(xiàn)粒體蛋白；METTL5和ZCCHC4分別位于核仁和細(xì)胞核，即核糖體生物發(fā)生的初始步驟。有研究報(bào)道，人類(lèi)METTL5與RNA特異性結(jié)合，但不與DNA結(jié)合。這些結(jié)果促使作者研究了METTL5和ZCCHC4是否可能是導(dǎo)致人類(lèi)rRNA上m 6 A沉積的酶。
   為了驗(yàn)證這一假設(shè)，通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯消除了人類(lèi)細(xì)胞（HCT116）二倍體兩個(gè)等位基因上蛋白質(zhì)的部分編碼序列，從METTL5中刪除了外顯子3，從ZCCHC4中刪除了外顯子7。三個(gè)獨(dú)立的mettl5-/-細(xì)胞系和兩個(gè)獨(dú)立的zcchc4-/-細(xì)胞系，通過(guò)PCR驗(yàn)證基因組DNA上兩個(gè)等位基因的缺失。為了測(cè)試METTL5和ZCCH4在核糖體RNA修飾中的作用，通過(guò)離心從不同的mettl5-和zcchc4缺失的細(xì)胞系以及對(duì)照HCT116細(xì)胞中純化了成熟的18S和28S rRNA，然后將其消化成核苷并用HPLC定量分析。在對(duì)照細(xì)胞中，m6A核苷很容易在純化的18s和28s中檢測(cè)到，48分鐘洗脫。在所有三個(gè)mettl5-/-細(xì)胞中，18S rRNA m6A峰丟失，而28S rRNA m6A峰保持不受影響。相反，在兩個(gè)zcchc4-/-克隆中，18S rRNA m6A峰不變，而28S rRNA m6A峰消失。這些數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論， METTL5和ZCCHC4是人類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶，分別負(fù)責(zé)在18S rRNA上形成m 6 A 1832和在28S rRNA 上形成m 6 A 4220。ZCCHC4鑒定為28S rRNA m6A修飾酶與最近的文獻(xiàn)報(bào)道完全一致。

2.METTL5和ZCCHC4可作用于細(xì)胞生長(zhǎng)和核糖體生物發(fā)生
   確定了18S和28S rRNA m 6 A甲基化酶后，檢查這些修飾是否對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和核糖體生物發(fā)生有影響。首先，利用活體細(xì)胞染色計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)METTL5或ZCCHC4基因的對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。接下來(lái)，從HCT116細(xì)胞和ETTL5-/-和ZCCHCC4-/-細(xì)胞中提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和Ethylenediamine tetramine染色，以顯示成熟的18S和28S rRNA。發(fā)現(xiàn)缺失METTL5或ZCCHC4基因的細(xì)胞正常產(chǎn)生成熟的rRNA。通過(guò)定量高分辨率Northern印跡進(jìn)行的詳細(xì)的pre-rRNA加工分析顯示，所有主要的pre-rRNA種類(lèi)均帶有特異性探針，并且沒(méi)有重大差異?？傊琈ETTL5是18S rRNA m6A裝飾酶，ZCCHC4 是28S rRNAm6A裝飾酶，這兩種酶都不是細(xì)胞生長(zhǎng)或成熟rRNA產(chǎn)生所必需的，也不是任何沉積的修飾。

3.人METTL5與TRMT112形成異源二聚體，獲得代謝穩(wěn)定性
   在作者最近的研究中，旨在描述古細(xì)菌中甲基轉(zhuǎn)移酶激活劑Trm112的相互作用網(wǎng)絡(luò)。發(fā)現(xiàn)METTL5同源基因HVO _1475（以下簡(jiǎn)稱(chēng)HVO Mettl5，35％的序列同一性METTL5），這導(dǎo)致測(cè)試HvoMettl5是否可以直接與HvoTrm112相互作用，并由此擴(kuò)展人類(lèi)METTL5是否可能與TRMT112相互作用。Hvo Mettl5與Hvo Trm112發(fā)生物理相互作用，而人類(lèi)METTL5與TRMT112直接相關(guān)。當(dāng)ZCCHC4與TRMT112共表達(dá)時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到穩(wěn)定作用。通過(guò)X-射線(xiàn)衍射確定蛋白晶體結(jié)構(gòu)。人TRMT112包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：鋅結(jié)合域（ZBD）和中央域。

4.METTL5-TRMT112與DNA和RNAm6A甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)核糖體生物發(fā)生的意義比較
   METTL5-TRMT112的結(jié)構(gòu)是繼mElt3-METTL14，METL16和CAPAM之后的人類(lèi)確定的第四個(gè)RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)。沒(méi)有觀(guān)察到METTL5-TRMT112與上述三種甲基轉(zhuǎn)移酶有明顯的相似性。這表明METTL5-TRMT112可能以其自己的特定方式運(yùn)行。有趣的是，將METTL5-TRMT112的結(jié)構(gòu)與結(jié)合到短雙鏈DNA片段的m6A DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)了意想不到的共性。一個(gè)DNA鏈的目標(biāo)腺嘌呤環(huán)從雙螺旋中伸出并指向活性位點(diǎn)，并由105NPPY108標(biāo)記以及Val21和Phe196側(cè)鏈協(xié)調(diào)。這些分別對(duì)應(yīng)于人METTL5的126NPPF129，Tyr29和Tyr184，這可能像M. TaqI一樣在其活性位點(diǎn)目標(biāo)為腺嘌呤，最佳地定位腺嘌呤以將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到其N(xiāo)6原子上。

5.METTL5和ZCCHC4僅是m6A核糖體RNA的編輯器
   我們想知道是否METTL5-TRMT112或ZCCHC4可以進(jìn)行動(dòng)作在核糖體RNA以外的RNA底物上。為了驗(yàn)證這一問(wèn)題，使用miCLIP技術(shù)對(duì)缺少M(fèi)ETTL5或ZCCHC4的人類(lèi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行m6A的單核苷酸圖譜。雖然12346個(gè)m6A位點(diǎn)重新定位在同基因?qū)φ占?xì)胞的mRNA上；在缺少M(fèi)ETTL5或ZCCHC4的情況下，mRNA或lncRNA中的位點(diǎn)差異很大。miCLIP分析進(jìn)一步證實(shí)，METTL5-TRMT112負(fù)責(zé)18S rRNA m6A 1832安裝，ZCCHC4用于28S rRNA m6A 4220沉積?？傊琈ETTL5和ZCCHC4分別對(duì)18S和28S rRNA m6A修飾具有高度特異性。

結(jié)論：
   METTL5一個(gè)是負(fù)責(zé)18S rRNA m6A修飾的酶，并確認(rèn)ZCCHC4為28S rRNAm6A修飾酶；METTL5必須與甲基轉(zhuǎn)移酶激活劑TRMT112形成異源二聚體復(fù)合物，以在細(xì)胞中獲得代謝穩(wěn)定性。并且確定了METTL5-TRMT112的第一個(gè)原子分辨率結(jié)構(gòu)。