人18S rRNA m6A甲基轉移酶新發(fā)現——METTL5

   RNA甲基化在mRNA上被大量發(fā)現，rRNA甲基化修飾卻研究的很少，并且rRNA甲基化修飾作用仍不清楚。近日，來自法國巴黎理工學院的研究團隊在Nucleic Acids Research期刊上發(fā)表題名為：The human 18S rRNA m6A methyltransferase METTL5 is stabilized by TRMT112的研究文章。該文章主要發(fā)現METTL5一個是負責18S rRNA m6A修飾的酶，并確認ZCCHC4為28S rRNAm6A修飾酶；METTL5必須與已知的甲基轉移酶激活劑TRMT112形成異源二聚體復合物，以在細胞中獲得代謝穩(wěn)定性。文章還提供了METTL5-TRMT112的第一個原子分辨率結構。

1.鑒定m6A1832和m6A4220上沉積的18S和28S rRNA甲基轉移酶
   為了鑒定在18S rRNA的A 1832和28S rRNA的A 4220處沉積m 6 A 的甲基轉移酶，在UniProt數據庫中搜索了具有N6-腺苷特異性DNA甲基轉移酶。檢索到七個結果結果：HEMK1、HEMK2、TRMT11、MGAM2、METTL4、METTL5和ZCCHC4。根據人類蛋白質圖譜計劃，METTL4是人類U2-OS細胞中線粒體蛋白；METTL5和ZCCHC4分別位于核仁和細胞核，即核糖體生物發(fā)生的初始步驟。有研究報道，人類METTL5與RNA特異性結合，但不與DNA結合。這些結果促使作者研究了METTL5和ZCCHC4是否可能是導致人類rRNA上m 6 A沉積的酶。
   為了驗證這一假設，通過CRISPR-Cas9基因編輯消除了人類細胞（HCT116）二倍體兩個等位基因上蛋白質的部分編碼序列，從METTL5中刪除了外顯子3，從ZCCHC4中刪除了外顯子7。三個獨立的mettl5-/-細胞系和兩個獨立的zcchc4-/-細胞系，通過PCR驗證基因組DNA上兩個等位基因的缺失。為了測試METTL5和ZCCH4在核糖體RNA修飾中的作用，通過離心從不同的mettl5-和zcchc4缺失的細胞系以及對照HCT116細胞中純化了成熟的18S和28S rRNA，然后將其消化成核苷并用HPLC定量分析。在對照細胞中，m6A核苷很容易在純化的18s和28s中檢測到，48分鐘洗脫。在所有三個mettl5-/-細胞中，18S rRNA m6A峰丟失，而28S rRNA m6A峰保持不受影響。相反，在兩個zcchc4-/-克隆中，18S rRNA m6A峰不變，而28S rRNA m6A峰消失。這些數據可以得出結論， METTL5和ZCCHC4是人類甲基轉移酶，分別負責在18S rRNA上形成m 6 A 1832和在28S rRNA 上形成m 6 A 4220。ZCCHC4鑒定為28S rRNA m6A修飾酶與最近的文獻報道完全一致。

2.METTL5和ZCCHC4可作用于細胞生長和核糖體生物發(fā)生
   確定了18S和28S rRNA m 6 A甲基化酶后，檢查這些修飾是否對細胞生長和核糖體生物發(fā)生有影響。首先，利用活體細胞染色計數監(jiān)測細胞增殖，實驗結果表明無METTL5或ZCCHC4基因的對細胞生長沒有顯著影響。接下來，從HCT116細胞和ETTL5-/-和ZCCHCC4-/-細胞中提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳和Ethylenediamine tetramine染色，以顯示成熟的18S和28S rRNA。發(fā)現缺失METTL5或ZCCHC4基因的細胞正常產生成熟的rRNA。通過定量高分辨率Northern印跡進行的詳細的pre-rRNA加工分析顯示，所有主要的pre-rRNA種類均帶有特異性探針，并且沒有重大差異?？傊琈ETTL5是18S rRNA m6A裝飾酶，ZCCHC4 是28S rRNAm6A裝飾酶，這兩種酶都不是細胞生長或成熟rRNA產生所必需的，也不是任何沉積的修飾。

3.人METTL5與TRMT112形成異源二聚體，獲得代謝穩(wěn)定性
   在作者最近的研究中，旨在描述古細菌中甲基轉移酶激活劑Trm112的相互作用網絡。發(fā)現METTL5同源基因HVO _1475（以下簡稱HVO Mettl5，35％的序列同一性METTL5），這導致測試HvoMettl5是否可以直接與HvoTrm112相互作用，并由此擴展人類METTL5是否可能與TRMT112相互作用。Hvo Mettl5與Hvo Trm112發(fā)生物理相互作用，而人類METTL5與TRMT112直接相關。當ZCCHC4與TRMT112共表達時，沒有觀察到穩(wěn)定作用。通過X-射線衍射確定蛋白晶體結構。人TRMT112包含兩個結構域：鋅結合域（ZBD）和中央域。

4.METTL5-TRMT112與DNA和RNAm6A甲基轉移酶對核糖體生物發(fā)生的意義比較
   METTL5-TRMT112的結構是繼mElt3-METTL14，METL16和CAPAM之后的人類確定的第四個RNA m6A甲基轉移酶結構。沒有觀察到METTL5-TRMT112與上述三種甲基轉移酶有明顯的相似性。這表明METTL5-TRMT112可能以其自己的特定方式運行。有趣的是，將METTL5-TRMT112的結構與結合到短雙鏈DNA片段的m6A DNA甲基轉移酶的結構進行比較時，發(fā)現了意想不到的共性。一個DNA鏈的目標腺嘌呤環(huán)從雙螺旋中伸出并指向活性位點，并由105NPPY108標記以及Val21和Phe196側鏈協(xié)調。這些分別對應于人METTL5的126NPPF129，Tyr29和Tyr184，這可能像M. TaqI一樣在其活性位點目標為腺嘌呤，最佳地定位腺嘌呤以將甲基基團轉移到其N6原子上。

5.METTL5和ZCCHC4僅是m6A核糖體RNA的編輯器
   我們想知道是否METTL5-TRMT112或ZCCHC4可以進行動作在核糖體RNA以外的RNA底物上。為了驗證這一問題，使用miCLIP技術對缺少METTL5或ZCCHC4的人類細胞的轉錄組進行m6A的單核苷酸圖譜。雖然12346個m6A位點重新定位在同基因對照細胞的mRNA上；在缺少METTL5或ZCCHC4的情況下，mRNA或lncRNA中的位點差異很大。miCLIP分析進一步證實，METTL5-TRMT112負責18S rRNA m6A 1832安裝，ZCCHC4用于28S rRNA m6A 4220沉積?？傊琈ETTL5和ZCCHC4分別對18S和28S rRNA m6A修飾具有高度特異性。

結論：
   METTL5一個是負責18S rRNA m6A修飾的酶，并確認ZCCHC4為28S rRNAm6A修飾酶；METTL5必須與甲基轉移酶激活劑TRMT112形成異源二聚體復合物，以在細胞中獲得代謝穩(wěn)定性。并且確定了METTL5-TRMT112的第一個原子分辨率結構。