lncRNA Paupar通過調(diào)節(jié)PAX6的活性來促進(jìn)α細(xì)胞的發(fā)育和功能
許多研究強(qiáng)調(diào)了胰高血糖素分泌失調(diào)在高血糖癥和糖尿病病因中的作用。 因此，了解胰腺胰島細(xì)胞發(fā)育和功能的機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)糖尿病的新療法具有重要意義。 在這項(xiàng)研究中，胚胎小鼠胰腺和成年小鼠胰島之間的比較轉(zhuǎn)錄組分析確定了幾個(gè)胰腺lncRNA，這些胰腺lncRNA與必需的胰腺轉(zhuǎn)錄因子（包括Pax6相關(guān)的lncRNA Paupar）非常接近，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其分子功能。本文于今年10月發(fā)表在Cell Metabolism (IF:22.415)雜志上。
主要結(jié)果如下：
1、小鼠胰腺中調(diào)節(jié)發(fā)育的lncRNA鑒定
為了鑒定胰腺中受時(shí)間和空間調(diào)控的lncRNA，在成年小鼠胰島和胚胎第15.5天（e15.5）小鼠胰腺（EP）上進(jìn)行了RNA-seq。如圖1A識(shí)別出572個(gè)候選lncRNA。 使用下列標(biāo)準(zhǔn)來定義2,728個(gè)胰腺lncRNA：（1）長度> 200個(gè)核苷酸（nt），（2）與蛋白質(zhì)編碼區(qū)不重疊，（3）與假基因不重疊（Karro等，2007 ），以及（4）較低的預(yù)測編碼概率（圖1B）。FPKM 法處理過濾（圖1C）。這些參數(shù)產(chǎn)生了572個(gè)高信度胰腺lncRNA（圖1D）。兩個(gè)階段之間的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)表明，胰腺中大約一半lncRNA（279或48.7％）受到發(fā)育調(diào)控：108個(gè)lncRNA顯著富集EP和171個(gè)lncRNA中的SNP在成年胰島中顯著富集（圖1E）。為了獲得這些基因的功能，使用GREAT識(shí)別蛋白編碼的基因（圖1F），并對(duì)包括9個(gè)胰腺轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的基因做GO分析（圖1G）。
圖1系統(tǒng)鑒定小鼠胰腺中發(fā)育調(diào)節(jié)的lncRNA
2、Paupar是在胰腺α細(xì)胞中富集的一種細(xì)胞核lncRNA
Paupar是一個(gè)3482 nt基因，從Pax6上游反義轉(zhuǎn)錄8 kb，包含在Pax6os1的第一個(gè)內(nèi)含子中，是一個(gè)未知功能的反義RNA（圖2A）。Paupar位于小鼠2號(hào)染色體上和人類11號(hào)染色體上的同義保守區(qū)域（UCSC LiftOver）。在其基因和與推定啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)的區(qū)域（圖2A）中，有許多與lncRNA相似的功能。除了在人類中調(diào)控發(fā)育和保守外，我們還確定了db / db小鼠（T2D模型）的胰島中Paupar的表達(dá)降低了2倍，這表明Paupar可能在胰島功能障礙中起作用（圖2B）。圖2C和D是Paupar表達(dá)的時(shí)空特異性和組織特異性。與其他胰島細(xì)胞類型相比，F(xiàn)ACS純化的小鼠α細(xì)胞和非α胰島細(xì)胞的表達(dá)分析證實(shí)Paupar在細(xì)胞中高度富集，而Pax6在兩個(gè)細(xì)胞群中均表達(dá)相同（圖2E）。 Gcg和Ins2在α和β細(xì)胞中的表達(dá)水平證明了樣品的純度（圖2E）。圖2F說明Paupar主要富集在細(xì)胞核。
圖2 Paupar是在胰腺α細(xì)胞中富集的一種細(xì)胞核lncRNA
3、Paupar調(diào)節(jié)Pax6 α細(xì)胞靶基因
Paupar的表達(dá)譜促使我們研究其在細(xì)胞中的調(diào)節(jié)功能。 三組獨(dú)特的反義寡核苷酸（ASO）成功將αTC細(xì)胞中的Paupar RNA下調(diào)了57％（圖3A）。與以前在N2A細(xì)胞中報(bào)道的相反，這里觀察到Paupar敲低Pax6表達(dá)沒有變化（圖3A），這表明Paupar RNA不影響Pax6轉(zhuǎn)錄。而Paupar敲低導(dǎo)致幾個(gè)Pax6 α細(xì)胞靶基因下調(diào)，包括Gcg，MafB，Arx和NeuroD1（圖3A）。 此外，Paupar 敲低的量與Gcg（圖3B）和MafB（圖3C）表達(dá)的減少呈正相關(guān)。這些表明，PAX6介導(dǎo)的α細(xì)胞基因調(diào)控對(duì)αTC中Paupar水平敏感。
圖3 Paupar lncRNA調(diào)控α細(xì)胞PAX6靶基因，并與幾種參與選擇性剪接的核蛋白相互作用
4、Paupar lncRNA與核蛋白相互作用參與選擇性剪切
為了進(jìn)一步探究Paupar調(diào)控α細(xì)胞PAX6靶基因的分子機(jī)制，對(duì)RNA靶點(diǎn)進(jìn)行捕獲雜交分析（CHART）鑒定Paupar的相互作用組。兩組Paupar 生物素寡糖（COs）均從αTC核提取物中下拉到Paupar RNA(圖3D和3E)，但Paupar COs并沒有拉低Gapdh或TBP (圖3D和3E)，證明CHART富集是由RNA介導(dǎo)的?；?蛋白相互作用的檢索軟件顯示Paupa相互作用56個(gè)中的25個(gè)與Paupa相互作用的蛋白被預(yù)測至少與另一個(gè)與Paupa相互作用的蛋白作用(圖3F)。這些蛋白顯著富集于幾個(gè)圖3G途徑中。根據(jù)Paupar與12個(gè)帶注釋的富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子（SRSF）中的8個(gè)之間的直接交互作用（圖3F），預(yù)測到完整的Paupar轉(zhuǎn)錄本具有1,685個(gè)SRSF結(jié)合位點(diǎn)。幾個(gè)最重要的SRSF位點(diǎn)位于Paupar基因座區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域在整個(gè)胎盤哺乳動(dòng)物中具有高度序列保守性（圖3H，灰色矩形）。與Nkx2-2和Malat1相比，Paupar具有更多的SRSF結(jié)合位點(diǎn)，且Z值更高（圖3H）?？傊?，以上結(jié)果說明Paupar在α細(xì)胞中起調(diào)節(jié)選擇性剪接的作用。
5、Paupar促進(jìn)Pax6選擇性剪接成激活Pax6 α細(xì)胞靶基因所需的亞型
圖4A是Pax6的兩種亞型示意圖，盡管非定量RT-PCR可檢測到細(xì)胞中的兩種同工型（圖4B），但鑒于較短的Pax6同工型的擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生兩種同工型產(chǎn)物，我們只能量化Pax6 5a的表達(dá)（圖4A，黑色箭頭）。 為了直接測試Paupar是否促進(jìn)Pax6的可變剪接，我們對(duì)來自Paupar缺陷型αTC的RNA進(jìn)行了qRT-PCR。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Paupar KD并未導(dǎo)致總Pax6 mRNA水平的變化，但觀察到Pax6 5a的顯著特異性降低（45％）（圖4C）。 此外，Paupar介導(dǎo)的Pax6剪接調(diào)控直接通過RNA-RNA相互作用而不是通過SR剪接因子間接發(fā)生，因?yàn)镻aupar和Pax6 RNA之間的關(guān)聯(lián)可以通過RNase處理部分消除（圖4D）。PAX6 ChIP測序結(jié)果顯示，對(duì)照中，PAX6與26,244個(gè)基因組位點(diǎn)相關(guān)，在Paupar KD之后，大約10％的PAX6位點(diǎn)（2,046個(gè)峰）顯示出不同的結(jié)合（圖4E）。在Paupar KD上表現(xiàn)出差異結(jié)合的區(qū)域在啟動(dòng)子<1 kb的區(qū)域中較少，而更主要地位于基因間區(qū)域（圖4F）。對(duì)2046個(gè)差異結(jié)合的PAX6位點(diǎn)100 kb內(nèi)的基因進(jìn)行的GO分析顯示，主要富集在細(xì)胞功能相關(guān)的生物過程組分中，包括葡萄糖穩(wěn)態(tài)，離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)，和細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)（圖4G）。為了確定Paupar KD是否引起PAX6介導(dǎo)的細(xì)胞基因調(diào)控的整體變化，將與差異結(jié)合的PAX6位點(diǎn)相關(guān)的基因與已發(fā)布的富含在α細(xì)胞的基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)有60個(gè)基因具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著重疊（圖4H），重疊的60個(gè)基因包含Paupar KD失調(diào)的幾個(gè)基因，如Gcg和MafB（圖3A）。這些結(jié)果，以及Paupar KD引起Pax6 5a的特異性下調(diào)，而不是總的Pax6 mRNA的表達(dá)下調(diào)（圖4E），證明Paupar通過替代剪接賦予Pax6 5a的α細(xì)胞特異性調(diào)控功能。
圖4 Paupar促進(jìn)Pax6選擇性剪接成激活Pax6 α細(xì)胞靶基因所需的亞型
6、Paupar敲除小鼠損害α細(xì)胞的發(fā)育和功能
利用體內(nèi)胰島素耐受性測試（ITT）來評(píng)估Paupar KO小鼠對(duì)急性低血糖反應(yīng)的能力，與WT小鼠相比，Paupar KO小鼠降血糖明顯，這表明KO小鼠恢復(fù)基線血糖水平的效率較低（圖5A和B）。另外，Paupar KO小鼠不能應(yīng)對(duì)低血糖癥可能是由于胰高血糖素分泌受損，為了測試這一點(diǎn)，在ITT之前和期間測量了血漿胰高血糖素。胰島素注射后30分鐘，Paupar KO小鼠的血漿胰高血糖素相對(duì)于WT小鼠降低了2.5倍（圖5C），表明Paupar KO小鼠在低血糖反應(yīng)中分泌的胰高血糖素明顯減少。響應(yīng)低葡萄糖反應(yīng)，Paupar KO小鼠的分泌的胰高血糖素比野生型胰島少60％（圖5D）。為了確定這種鈍化的胰高血糖素分泌是否是由于胰島胰高血糖素含量降低所致，測量了胰島胰高血糖素的總含量，發(fā)現(xiàn)Paupar KO胰島的胰高血糖素總含量顯著低于對(duì)照（圖5E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Paupar KO胰島細(xì)胞生理功能受損部分是由于胰高血糖素含量降低所致。與生理表型一致，對(duì)Paupar WT和KO胰腺進(jìn)行形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞占Paupar WT胰島的13％（圖5F），但僅占Paupar KO胰島的6％（圖5F和G），相當(dāng)于α細(xì)胞群體平均減少了2.25倍（圖5H）。我們還觀察到與WT小鼠（71％）相比，Paupar KO小鼠（79％）β細(xì)胞面積相對(duì)于胰島面積有適度增加（圖5I-5K）。Paupar WT和KO小鼠之間的平均胰島大小沒有可測量的差異（圖5L-5N）。以上結(jié)果表明，Paupar是細(xì)胞正常發(fā)育和功能所必需的。
圖5 Paupar敲除小鼠損害α細(xì)胞的發(fā)育和功能
7、Paupar在體內(nèi)調(diào)節(jié)必須的α細(xì)胞基因
對(duì)Paupar WT和KO6周齡小鼠的胰島進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，得到3,106個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）（圖6A）。與α細(xì)胞特異性表型一致，DEG占所有已記錄的富含α細(xì)胞的基因的10％以上（圖6B）。此外，DEG包括許多細(xì)胞功能所需的因子和許多已知的PAX6a細(xì)胞靶標(biāo)，包括轉(zhuǎn)錄因子（Arx，MafB，Irx1和Irx2）控離子通道（Kcnq2，Kcnip3）和胞吐機(jī)制（Sytl5和Sytl2）（圖6C）。與體外研究一致，Paupar KO小鼠的細(xì)胞Pax6 5a以及PAX6 α細(xì)胞靶基因顯著下調(diào)，而總Pax6 mRNA水平未發(fā)生變化（圖6D）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明Paupar介導(dǎo)的對(duì)PAX6 α細(xì)胞靶基因的調(diào)控是Pax6剪接而非轉(zhuǎn)錄水平。為了擴(kuò)展對(duì)Paupar介導(dǎo)的PAX6靶基因調(diào)控的了解，確定了胰島中Paupar調(diào)控的3,056個(gè)基因與αTC中Paupar KD引起的PAX6結(jié)合改變的相關(guān)基因（2,056個(gè)）的關(guān)系。分析顯示兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間328個(gè)基因顯著重疊（圖6E），包括許多必需的細(xì)胞基因，例如MafB，Arx，Irx1和Irx2，它們的失調(diào)可以直接解釋Paupar KO小鼠的表型。
圖6 Paupar在體內(nèi)調(diào)節(jié)必須的α細(xì)胞基因
基于綜上研究，作者提出一個(gè)模型，其中Paupar通過調(diào)節(jié)PAX6 a細(xì)胞靶基因所需的Pax6 5a亞型的選擇性剪接來促進(jìn)細(xì)胞功能（圖7）。
圖7 Paupa介導(dǎo)的pax6 α細(xì)胞靶基因調(diào)控模型
總而言之，本文對(duì)α細(xì)胞富集的lncRNA的分子和功能表征表明，lncRNA可能代表重要的組織和/或細(xì)胞受限治療靶標(biāo)，以調(diào)節(jié)更廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)的細(xì)胞特異性亞型的產(chǎn)生和功能。
參考文獻(xiàn)：
Singer Ruth A., Arnes Luis., Cui Yi., Wang Jiguang., Gao Yuqian., Guney Michelle A., Burnum-Johnson Kristin E., Rabadan Raul., Ansong Charles., Orr Galya., Sussel Lori., (2019). The Long Noncoding RNA Paupar Modulates PAX6 Regulatory Activities to Promote Alpha Cell Development and Function., Cell Metab., undefined, undefined.