環(huán)狀RNA circPPP1R12A編碼的蛋白通過Hippo-YAP信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移
欄目：最新研究動(dòng)態(tài)
發(fā)布時(shí)間：2020-01-07
circRNA通常通過作為miRNA海綿調(diào)節(jié)基因表達(dá)，但circRNA編碼的肽段在腫瘤作用仍不明確......
環(huán)狀RNA（circRNA）在腫瘤進(jìn)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。circRNA通常通過作為miRNA海綿調(diào)節(jié)基因表達(dá)，但circRNA編碼的肽段在腫瘤作用仍不明確。近期，來自蘇州大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer期刊上發(fā)表題名為A novel protein encoded by a circular RNA circPPP1R12A promotes tumor pathogenesis and metastasis of colon cancer via Hippo-YAP signaling的文章。該文章揭示了結(jié)腸癌（CC）進(jìn)程中circRNA circPPP1R12A的編碼肽段的作用，circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路促進(jìn)了CC的腫瘤發(fā)病和轉(zhuǎn)移。
1、CC組織和細(xì)胞中circRNA的表達(dá)譜和篩選
使用circRNA基因芯片確定10例結(jié)腸癌患者癌和癌旁組織circRNA表達(dá)譜。在CC與癌旁組織間共有126個(gè)差異表達(dá)的circRNA；與癌旁組織相比，在CC組織中有110個(gè)circRNA上調(diào)，有16個(gè)circRNA下調(diào)。這些circRNAs大多位于外顯子區(qū)域。hsa_circ_0000423（circPPP1R12A）在CC組織中上調(diào)最為明顯，由位于12q21.2 PPP1R12A基因24、25外顯子反向拼接而成。接下來通過qRT-PCR檢測20例CC患者癌和癌旁組織中circPPP1R12A表達(dá)，確定其表達(dá)升高。與正常人結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系NCM460細(xì)胞相比，circPPP1R12A表達(dá)在CC細(xì)胞系（HT-29，HCT-116，SW480，SW620，LoVo，SW48，DLD-1，Caco2和HCT-15）中明顯上調(diào)。
使用circRNA基因芯片確定10例結(jié)腸癌患者癌和癌旁組織circRNA表達(dá)譜。在CC與癌旁組織間共有126個(gè)差異表達(dá)的circRNA；與癌旁組織相比，在CC組織中有110個(gè)circRNA上調(diào)，有16個(gè)circRNA下調(diào)。這些circRNAs大多位于外顯子區(qū)域。hsa_circ_0000423（circPPP1R12A）在CC組織中上調(diào)最為明顯，由位于12q21.2 PPP1R12A基因24、25外顯子反向拼接而成。接下來通過qRT-PCR檢測20例CC患者癌和癌旁組織中circPPP1R12A表達(dá)，確定其表達(dá)升高。與正常人結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系NCM460細(xì)胞相比，circPPP1R12A表達(dá)在CC細(xì)胞系（HT-29，HCT-116，SW480，SW620，LoVo，SW48，DLD-1，Caco2和HCT-15）中明顯上調(diào)。
2、CC細(xì)胞和組織中circPPP1R12A的存在和亞細(xì)胞分布的特征
實(shí)驗(yàn)根據(jù)circPPP1R12A特征設(shè)計(jì)了兩組引物。一組（divergent primers，發(fā)散引物）用于擴(kuò)增環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物，而另一組（convergent primers，收斂引物）用于檢測線性轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果表明，收斂引物可以用于cDNA和gDNA擴(kuò)增，而發(fā)散引物只能用于cDNA擴(kuò)增。為了進(jìn)一步證實(shí)circPPP1R12A的存在，使用RNase R降解試驗(yàn)評估circPPP1R12A對RNase R處理的抗性。結(jié)果顯示，通過RNase R處理降解了PPP1R12A的線性轉(zhuǎn)錄物，而這種處理未能降解circPPP1R12A的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物。核質(zhì)量分離測定法和FISH分析結(jié)果顯示93％以上的circPPP1R12A出現(xiàn)在HCT-116和LoVo細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。還通過原位雜交技術(shù)檢測100例CC患者癌和癌旁組織中circPPP1R12A的表達(dá)。結(jié)果表明circPPP1R12A在CC組織中的表達(dá)高于正常組織，并且這種表達(dá)上調(diào)與更高的TNM分期呈正相關(guān)。并且生存曲線表明，circPPP1R12A表達(dá)較高的患者的總生存期較短。
3、circPPP1R12A促進(jìn)細(xì)胞增殖
在兩個(gè)低circPPP1R12A表達(dá)的CC細(xì)胞系（DLD-1和Caco-2）中通過質(zhì)粒過表達(dá)了circPPP1R12A，并通過PCR驗(yàn)證過表達(dá)效率。CCK8和集落形成的結(jié)果表明，circPPP1R12A過表達(dá)加速了DLD-1和Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞增殖。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell結(jié)果表明，過表達(dá)circPPP1R12A也增強(qiáng)DLD-1和Caco-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，在兩個(gè)高表達(dá)circPPP1R12A的CC細(xì)胞系（HCT-116和LoVo）中通過質(zhì)粒過表達(dá)了circPPP1R12A。通過CCK8和集落形成結(jié)果證明，circPPP1R12A過表達(dá)加速了HCT-116和LoVo細(xì)胞的細(xì)胞增殖。但是，circPPP1R12A過表達(dá)未能在劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell中顯示對CC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
4、敲低circPPP1R12A可抑制CC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力
接下來，研究敲低circPPP1R12A對細(xì)胞增殖，遷移和侵襲性的影響。通過PCR證驗(yàn)證敲低效率，circPPP1R12A的敲低影響了兩個(gè)高表達(dá)細(xì)胞系的增殖（圖和集落形成的能力。在劃痕和Transwell測定中，circPPP1R12A的敲低顯著影響HCT-116和LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些結(jié)果表明，circPPP1R12A在CC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
5、CircRNA circPPP1R12A編碼一個(gè)小的未鑒定蛋白
circRNA circPPP1R12A最初是在circRNA Db數(shù)據(jù)庫中標(biāo)注的，因此發(fā)現(xiàn)circPPP1R12A具有一個(gè)短的216 nt的小ORF，具有編碼73個(gè)氨基酸肽段的潛力。在人類circPPP1R12A中，環(huán)化產(chǎn)生了起始密碼子AUG，該起始密碼子與遺傳密碼一起開始翻譯。circPPP1R12A的ORF應(yīng)該被翻譯成73個(gè)氨基酸的蛋白，稱之為circPPP1R12A-73aa。設(shè)計(jì)標(biāo)記的過表達(dá)載體（Lv-flag-circPPP1R12A），突變一個(gè)位點(diǎn)的載體（Lv-flag-circPPP1R12A-Mut）和過表達(dá)circPPP1R12A-73aa mRNA的載體。PCR驗(yàn)證DLD-1和Caco-2細(xì)胞過表達(dá)效率，WB檢測DLD-1和Caco-2細(xì)胞circPPP1R12A-73aa蛋白表達(dá)情況。通過LC-MS / MS從證實(shí)circPPP1R12A翻譯了circPPP1R12A-73aa，并確定了circPPP1R12A-73aa的獨(dú)特的氨基酸序列。在LC-MS / MS結(jié)果中，從10 kDa條帶中鑒定出超過76％的circPPP1R12A-73aa序列。另外，鑒定了由circPPP1R12A翻譯獨(dú)特的氨基酸序列為“ GRLRHVNCLSPGVQD”。
6、CircPPP1R12A-73aa在體外和體內(nèi)促進(jìn)CC的增殖和轉(zhuǎn)移能力
為了進(jìn)一步探索circPPP1R12A-73aa的生物學(xué)功能，在低表達(dá)CC細(xì)胞系DLD-1和Caco-2中穩(wěn)轉(zhuǎn)上述過表達(dá)載體。CCK8、集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期結(jié)果證實(shí)過表達(dá)circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa增加的細(xì)胞增殖能力。然而突變的circPPP1R12A的過表達(dá)組中，不能翻譯circPPP1R12A-73aa，不能增加DLD-1和Caco-2細(xì)胞的增殖能力。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell結(jié)果中，過表達(dá)circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa增強(qiáng)了遷移和侵襲的能力，突變體circPPP1R12A的過表達(dá)未能提高這些能力。這些數(shù)據(jù)表明，如果沒有circPPP1R12A編碼蛋白circPPP1R12A-73aa參與，circPPP1R12A并不能直接調(diào)控CC細(xì)胞的增殖。接下來，利用異種移植腫瘤模型進(jìn)一步研究了circPPP1R12A-73aa在體內(nèi)CC細(xì)胞生長中的作用。過表達(dá)circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa組中腫瘤體積和重量明顯大于載體對照組和突變組。并且在小鼠生物發(fā)光成像結(jié)果中，突變組的腫瘤肝轉(zhuǎn)移顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明， 是circPPP1R12A編碼的circPPP1R12A-73aa促進(jìn)了CC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而不是circPPP1R12A。
7、circPPP1R12A-73aa通過激活hippo-YAP信號通路促進(jìn)CC的增殖，遷移和侵襲能力
對四組穩(wěn)轉(zhuǎn)DLD-1細(xì)胞進(jìn)行RNA測序分析，篩選出差異表RNA，以確定可能的信號通路。通過KEGG通路分析，篩選出差異信號通路。Hippo-YAP作為最豐富的信號通路接受下一步WB驗(yàn)證。YAP1是Hippo信號通路中的轉(zhuǎn)錄共激活子，而YAP1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要。為了驗(yàn)證YAP1激活是否為癌細(xì)胞的circPPP1R12A-73aa誘導(dǎo)的生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，在過表達(dá)circPPP1R12A-73aa的DLD-1和Caco-2 DLD-1和Caco-2和Caco-2細(xì)胞系中加入YAP1抑制劑肽17，實(shí)驗(yàn)結(jié)果肽17顯著抑制了因circPPP1R12A-73aa過表達(dá)引起的CC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力增強(qiáng)。
結(jié)論：
CC組織和細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了circRNA circPPP1R12A高表達(dá)。circPPP1R12A編碼的circPPP1R12A-73aa促進(jìn)了CC細(xì)胞在體內(nèi)與體外增殖和轉(zhuǎn)移，而不是circPPP1R12A。circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路提高了CC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力。
CC組織和細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了circRNA circPPP1R12A高表達(dá)。circPPP1R12A編碼的circPPP1R12A-73aa促進(jìn)了CC細(xì)胞在體內(nèi)與體外增殖和轉(zhuǎn)移，而不是circPPP1R12A。circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路提高了CC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力。