LncRNA PVT1與食管腺癌的關(guān)系揭秘

   PVT1在許多腫瘤類型中已作為致癌基因出現(xiàn)。然而，其在Barrett食管（BE）和食管腺癌（EAC）中的作用尚不清楚。本研究的目的是評估PVT1在BE/EAC進展中的作用，并揭示其對EAC的治療價值。本文通過qPCR檢測PVT1在正常、BE、EAC組織中的表達，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，以確定PVT1表達與EAC（分期、轉(zhuǎn)移、生存）的關(guān)系，并檢測PVT1反義寡核苷酸（ASOs）的體內(nèi)外抗腫瘤活性。

結(jié)果：
1.PVT1 lncRNA在EAC患者中的過表達與不良預(yù)后相關(guān)
   首先，利用TCGA數(shù)據(jù)集分析了多種癌癥類型的PVT1基因組改變，我們發(fā)現(xiàn)ESCA是第二大癌癥類型，存在20% PVT1擴增，約75%的ESCA病例同時存在擴增和重復(fù)（圖1a）。進一步分析兩種主要的ESCA亞型EAC和ESCC，我們發(fā)現(xiàn)EAC患者具有相對較高的PVT1擴增，其在西方人群中的發(fā)病率也較高，這使我們關(guān)注EAC（圖1b）。與ESCA中TCGA RNA Seq數(shù)據(jù)整合后，無論是復(fù)制還是擴增，PVT1的遺傳改變與PVT1的表達水平顯著相關(guān)（圖1c），提示EC中PVT1的遺傳改變導(dǎo)致其mRNA水平上調(diào)。為了證實TCGA數(shù)據(jù)集的發(fā)現(xiàn)，接下來，我們用qPCR在我們自己的患者隊列中檢測PVT1 lncRNA的表達。結(jié)果表明，PVT1 lncRNA的表達升高與BE的進展存在顯著的相關(guān)性（圖1d）。而且MYC mRNA在EACs中也顯著升高（圖1e）。另外，我們發(fā)現(xiàn)PVT1表達與臨床特征顯著相關(guān)。如圖2a所示，PVT1高表達與高T期、高N期、腫瘤分級不良顯著相關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示，與PVT1 lncRNA表達水平較低的EAC患者相比，PVT1 lncRNA表達水平較高的EAC患者總體生存期較短（圖2b）。

2.PVT1的抑制抑制了EAC細胞在體內(nèi)外的生長
   通過qPCR檢測PVT1在正常食管上皮細胞系和4個EAC細胞系的表達。與HET-1A細胞系相比，EAC細胞系中PVT1 lncRNA水平明顯升高（圖3a）。隨后，我們評估了人類PVT1特異性ASOs，發(fā)現(xiàn)三種PVT1 ASOs （ASO 4、ASO 5和ASO 6）在EAC細胞系中以劑量依賴的方式有效抑制了PVT1的表達（圖3b）。為了進一步闡明PVT1 ASOs對EAC細胞的抑制作用，我們在JHESO和OE19細胞中進行了集落形成和細胞遷移實驗。結(jié)果表明，與未處理或?qū)φ战M相比，PVT1 ASOs均可顯著抑制EAC細胞的集落形成，且呈劑量依賴性（圖3c）。同樣，細胞侵襲實驗顯示，PVT1 ASOs處理EAC細胞后，侵襲細胞數(shù)量明顯減少（圖3d）。為了進一步研究PVT1 ASO抑制PVT1是否會影響體內(nèi)腫瘤生長，裸小鼠皮下注射JHESO細胞。小鼠隨機分為對照組和PVT1組。治療3周后觀察腫瘤生長和腫瘤體積。PVT1 ASO組腫瘤體積及重量較對照組明顯下降（圖3e）。此外，經(jīng)qPCR檢測，PVT1 ASO治療組腫瘤組織中PVT1的表達較對照組明顯下降（圖3f）。這些結(jié)果證實了PVT1 ASO對EAC的體外和體內(nèi)抑制作用。

3.PVT1 ASOs抑制EAC細胞的CSC特性
   為了評估PVT1對EAC細胞的CSC特性的影響，我們對暴露于PVT1 ASOs的JHESO和OE19細胞系進行了腫瘤球?qū)嶒?。從圖4a和圖b可以看出，PVT1 ASOs處理后，與對照組ASO治療的EAC細胞相比，JHESO和OE19細胞中腫瘤球的形成均明顯減少。當(dāng)ASOs敲除PVT1后，ALDH1A1+細胞數(shù)量明顯減少（圖4c）。此外，ALDH1表達的減少與腫瘤球的大小和數(shù)量的顯著減少相一致。這些結(jié)果提示PVT1 lncRNA與EAC的CSC相關(guān)，可能在EAC的腫瘤發(fā)生/進展中起關(guān)鍵作用。

4.YAP1對EAC中PVT1的正反饋調(diào)節(jié)作用
   為了識別EAC中參與調(diào)控PVT1的分子通路，我們使用PVT1 ASO對未經(jīng)處理和處理的EAC細胞系進行了多個信號通路的RPPA分析。結(jié)果顯示，與對照組細胞相比，經(jīng)PVT1處理的細胞中YAP1的表達明顯下調(diào)；相反，磷酸化的YAP1增加（圖5a），表明YAP1是PVT1潛在的下游靶標(biāo)。接著通過qPCR進一步證實了PVT1和YAP1表達之間的相關(guān)性，即PVT與YAP1表達顯著相關(guān)（圖5b）。Pearson相關(guān)分析表明，YAP1表達與PVT1呈正相關(guān)（圖5b）。為了進一步證實PVT1與YAP1的正相關(guān)關(guān)系，我們以PVT1 ASOs為工具，測定EAC細胞系OE19和JHESO中PVT1被抑制后YAP1的變化。如圖5c所示，在兩個EAC細胞系中，控制YAP1磷酸化和降解的直接上游激酶磷酸化lats1在PVT1 ASO治療后呈劑量依賴性增加。與之相對應(yīng)，PVT1 ASO處理的JHESO和OE19細胞中，Ser 127磷酸化的YAP1也顯著升高，而YAP1的表達降低（圖5c）。免疫熒光染色進一步證實YAP1核表達顯著降低，而LATS1磷酸化增加（圖5d）。
   為了驗證YAP1是否反過來影響PVT1的表達，我們在SKGT-4 EAC細胞中產(chǎn)生了可誘導(dǎo)的YAP1 cDNA表達。如圖5e所示，成功誘導(dǎo)YAP1可顯著增加PVT1表達，與YAP1水平升高及其下游靶點SOX9、CTGF相關(guān)；與此相反，通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在SKGT-4細胞中高效敲除YAP1，在兩個克?。╕AP1 KO1和YAP1 KO2）中顯著降低了PVT1的表達，這與YAP1蛋白和mRNA水平的降低有關(guān)（圖5f）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，PVT1和YAP1都是相關(guān)的，并相互積極調(diào)節(jié)，這可能為EAC的治療提供一種新的機制上的見解。

5.同時抑制PVT1和YAP1可增強EAC細胞的體內(nèi)外生長抑制
   為了研究PVT1和YAP1聯(lián)合抑制是否具有更強的EAC抗腫瘤活性，我們利用PVT1和YAP1特異性ASOs進行了體外和體內(nèi)實驗。如圖6a所示，雖然單獨使用PVT1 ASO或YAP1 ASO均可顯著抑制PVT和YAP1的表達，但二者聯(lián)合使用ASOs時，二者均可同時抑制PVT和YAP1的表達。在功能上，當(dāng)用PVT1或YAP1 ASOs處理JHESO和OE19 EAC細胞時，ASO治療組的菌落形成數(shù)量和平均大小均顯著減少。此外，與單獨使用ASO治療的EAC細胞相比，聯(lián)合使用JHESO和OE19細胞的菌落更少（圖6b）。這些數(shù)據(jù)表明，阻斷PVT1和YAP1可在體外協(xié)同抑制EAC細胞生長。
   為了評價其體內(nèi)抗腫瘤作用，我們在JHESO異種移植小鼠模型中單獨或聯(lián)合使用PVT1和YAP1特異性ASOs，檢測了PVT1和YAP1特異性ASOs的抗腫瘤作用。裸鼠皮下注射JHESO細胞后，隨機分為4組（分別用對照ASO、PVT1 ASO、YAP1 ASO和聯(lián)合ASO治療）。體內(nèi)異種移植實驗表明，與單純使用ASO手術(shù)治療相比，同時使用兩種ASOs治療可顯著降低腫瘤生長（圖6c-e），體重沒有明顯變化（圖6f）。綜上所述，這些結(jié)果表明在EAC細胞中存在著PVT1和YAP1的相互調(diào)控，同時抑制PVT1和YAP1比單獨抑制任何一個基因更能有效抑制EAC腫瘤的生長。因此，利用特異性ASOs聯(lián)合抑制YAP1和PVT1為EAC提供了一種新的治療策略。

結(jié)論：
   PVT1對EAC具有侵襲性表型，是一個較差的預(yù)后因子。PVT1和YAP1聯(lián)合靶向治療提供了最高的治療指標(biāo)，代表了一種新的治療策略。