CAFs分泌的外泌體通過(guò)增強(qiáng)的細(xì)胞干性和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和化療耐藥

導(dǎo)語(yǔ):
相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）：是一種處于持續(xù)活化狀態(tài)的基質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用。結(jié)直腸癌 (（CRC）：指結(jié)腸或直腸內(nèi)的細(xì)胞異常生長(zhǎng)所形成的癌癥，是全球第三大最常見的惡性腫瘤。癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）是在腫瘤進(jìn)展中起主要作用的關(guān)鍵基質(zhì)細(xì)胞。但是，CAFs衍生分子調(diào)控大腸癌（CRC）轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性的分子決定因素尚未完全表征。

技術(shù)路線:
1.從結(jié)腸癌（CRC）和鄰近的正常組織中獲得CAFs和NFs。
2.使用超速離心法和外泌體快速沉淀試劑盒從培養(yǎng)基和血清中分離外泌體，并通過(guò)透射電子顯微鏡，納米跟蹤分析和免疫印跡進(jìn)行表征觀察。
3.MicroRNA微陣列用于鑒定CAFs或 (NFs)分泌的外泌體中差異表達(dá)的miRNA。
4.外泌體的內(nèi)化并通過(guò)免疫熒光觀察miR-92a-3p的轉(zhuǎn)移
5.使用博伊登（Boyden）室驗(yàn)證遷移和侵襲性，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8，流式細(xì)胞術(shù)，平板集落形成，球形成實(shí)驗(yàn)，尾靜脈注射等來(lái)以探討CAFs和NFs對(duì)原發(fā)性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用，以及他們分泌的外泌體對(duì)結(jié)腸癌中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，干細(xì)胞特性，轉(zhuǎn)移和化療耐藥性的影響。
6.運(yùn)用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)，實(shí)時(shí)定量PCR，免疫印跡，免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色來(lái)探討miR-92a-3p，F(xiàn)BXW7和MOAP1對(duì)CRC轉(zhuǎn)移和化療耐藥的調(diào)節(jié)作用。
研究結(jié)果:
1.CAFs分泌的外泌體促進(jìn)CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和抵抗5-FU / L-OHP。從結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)的正常結(jié)直腸粘膜中獲得了CAFs和NFs。與用NFs-CM處理的細(xì)胞相比，用CAFs-CM處理過(guò)的結(jié)腸癌細(xì)胞顯示出更高的遷移和侵襲能力，用CAFs-CM處理的CRC細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的5-FU / L-OHP治療抗性。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）揭示了杯狀結(jié)構(gòu)外泌體，并測(cè)定了外泌體標(biāo)記物CD63，CD81和TSG101蛋白在這些囊泡中陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察到PKH67標(biāo)記的外泌體被CRC細(xì)胞內(nèi)化。在小鼠模型中，CAFs-CM中外泌體的消耗抑制了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成。去除了外泌體的CAFs-CM處理CRC細(xì)胞時(shí)，CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低。經(jīng)5-FU / L-OHP治療, CAFs-CM處理的CRC細(xì)胞具有更高的存活和集落形成能力以及更低的細(xì)胞凋亡。用CAFs-exos處理的CRC細(xì)胞形成了較大的球體、癌干細(xì)胞性標(biāo)記物CD133、間充質(zhì)標(biāo)記物等明顯增加，上皮標(biāo)記物降低，CAFs-exos誘導(dǎo)CRC細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。以上結(jié)果表明，CAFs分泌的外泌體可能通過(guò)增強(qiáng)CRC中的干細(xì)胞特性和EMT來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)移和5-FU / L-OHP抵抗。
 

2.miR-92a-3p從CAFs直接轉(zhuǎn)移到CRC細(xì)胞。使用miRNA芯片測(cè)序，實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證了在差異表達(dá)的miRNA中，CAF-exos和SW480CAFs-exos細(xì)胞中miR-92a-3p，miR-181d，miR-221，miR-125b，miR-185和miR-625的水平顯著增加。miR-92a-3p在CAFs和CAFs-exos的表達(dá)水平明顯增高，在SW480CAFs-exos，SW620CAFs-exos和LOVOCAFs-exos細(xì)胞中，MiR-92a-3p水平也顯著增加。說(shuō)明CAFs-exos與CRC細(xì)胞中miR-92a-3p的增加有關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-92a-3p sponge 或者miR-NC，轉(zhuǎn)染MiR-92a-3p的細(xì)胞中，MiR-92a-3p明顯下降。然而，同NFs-exos相比，與CAFs-exos孵育后，圖中三種CRC細(xì)胞中miR-92a-3p水平明顯升高。說(shuō)明CRC細(xì)胞中miR-92a-3p的增加不是miRNA內(nèi)源性合成的結(jié)果，而是CAFs-exos直接轉(zhuǎn)移的結(jié)果。使用Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也說(shuō)明了miR-92a-3p通過(guò)外泌體直接從CAFs轉(zhuǎn)移到CRC細(xì)胞。

3.CAFs分泌的miR-92a-3p可增強(qiáng)CRC的干細(xì)胞特性，EMT，轉(zhuǎn)移和5-FU / L-OHP抵抗力。將miR-92a-3p-sponge轉(zhuǎn)染到CAFs-exos中可以大大減少了SW480CAFs-exos，SW620CAFs-exos和LOVOCAFs-exos細(xì)胞的遷移和侵襲。將miR-92a-3p模擬物重新引入CRC細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)miR-92a-3p海綿介導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲抑制作用。將SW620細(xì)胞注射到小鼠的腹側(cè)面，形成皮下腫瘤。 注射SW620CAFs-exos細(xì)胞的小鼠的肝轉(zhuǎn)移數(shù)量要多于注射SW620NFs-exos細(xì)胞的小鼠，而與對(duì)照組相比，用miR-92a-3p海綿轉(zhuǎn)染的CAFs-exos處理的SW620細(xì)胞的注射可以減少肝轉(zhuǎn)移。在體外和體內(nèi)測(cè)定了CAFs-外泌體miR-92a-3p對(duì)CRC細(xì)胞對(duì)5-FU / L-OHP治療效果的影響。在CRC細(xì)胞中重新導(dǎo)入miR-92a-3p可以大大增強(qiáng)CRC細(xì)胞中的N-鈣粘蛋白和波形蛋白，并抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)。綜上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：CAFs通過(guò)將外泌體miR-92a-3p轉(zhuǎn)移至CRC細(xì)胞，促進(jìn)了CRC的轉(zhuǎn)移和5-FU / L-OHP耐藥性并增強(qiáng)了干細(xì)胞特性和EMT。

4.FBXW7和MOAP1是miR-92a-3p的下游靶點(diǎn)。在表達(dá)miR-92a-3p的HEK293A，SW480，SW620和LOVO細(xì)胞中，具有野生型的FBXW7或MOAP1的酶活性被顯著抑制。相反，突變的FBXW7或MOAP1的熒光素酶活性沒(méi)有改變。此外，與Mock細(xì)胞相比，在表達(dá)miR-92a-3p的CRC細(xì)胞中FBXW7和MOAP1顯著降低（圖4d，e）。另外，與對(duì)照組相比，SW480CAFs-exos，SW620CAFs-exos和LOVOCAFs-exos細(xì)胞中的FBXW7和MOAP1蛋白均受到抑制，然而在CRC細(xì)胞中重新導(dǎo)入FBXW7和MOAP1則增加miR-92a-3p的水平。這些結(jié)果表明FBXW7和MOAP1是CRC細(xì)胞中miR-92a-3p的下游靶標(biāo)。

5.FBXW7和MOAP1在體內(nèi)和體外減弱miR-92a-3p介導(dǎo)的CRC的干細(xì)胞特性，轉(zhuǎn)移和5-FU / L-OHP抗性。分別用FBXW7和MOAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480，SW620和LOVO細(xì)胞。博伊登室試驗(yàn)表明，F(xiàn)BXW7的重新引入可以抑制miR-92a-3p介導(dǎo)的促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移和侵襲。此外，在5-FU / L-OHP處理下，F(xiàn)BXW7和MOAP1的重新表達(dá)顯著降低了CRC細(xì)胞的集落形成和存活能力。 FBXW7的過(guò)表達(dá)抑制了miR-92a-3p的表達(dá)從而導(dǎo)致干細(xì)胞特性，增殖和EMT表型受到抑制，MOAP1 可誘導(dǎo)了CRC細(xì)胞中凋亡蛋白BAX的表達(dá)和半胱天冬酶-3的裂解，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡。構(gòu)建了細(xì)胞的慢病毒感染。SW620 / miR-92a-3p細(xì)胞在肺和肝臟中顯著形成更多的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。在5 FU / LOHP治療下，引入FBXW7胞可減少源自 miR-92a-3p細(xì)胞的皮下腫瘤，miR-92a-3p / FBXW7細(xì)胞衍生的腫瘤具有：較低的ki67增殖指數(shù)，但凋亡細(xì)胞和（caspase-3）凋亡蛋白表達(dá)卻有所增加。這些結(jié)果表明FBXW7和MOAP1可以在體內(nèi)減輕miR-92a-3p介導(dǎo)的CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和化療耐藥性。

6.FBXW7和MOAP1通過(guò)促進(jìn)β-catenin的泛素化降解和線粒體凋亡來(lái)逆轉(zhuǎn)miR-92a-3p的致癌作用。外源性miR-92a-3p的引入可顯著增加CRC細(xì)胞核中β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達(dá)，而在表達(dá)miR-92a-3p的細(xì)胞中重新引入FBXW7會(huì)降低細(xì)胞核中β-catenin的表達(dá)。miR-92a-3p的過(guò)度表達(dá)在CRC細(xì)胞中增加了CD133，CD44，OCT4，N-鈣黏著蛋白，MMP7，MMP9但降低了E-鈣黏著蛋白。相反，在miR-92a-3p表達(dá)細(xì)胞中FBXW7的過(guò)表達(dá)卻顯示出相反的作用。發(fā)現(xiàn)FBXW7通過(guò)促進(jìn)CRC細(xì)胞中的β-catenin泛素化和降解來(lái)抑制細(xì)胞核中的β-catenin. 在5-FU / L-OHP治療下, MOAP1減弱miR-92a-3p對(duì)CRC化療耐藥性作用的機(jī)制。這一過(guò)程說(shuō)明FBXW7和MOAP1通過(guò)促進(jìn)β-catenin的泛素化降解和線粒體凋亡來(lái)逆轉(zhuǎn)miR-92a-3p的致癌作用。

7.MiR-92a-3p與FBXW7和MOAP1負(fù)相關(guān)，血清中miS-92a-3p的高表達(dá)可預(yù)測(cè)CRC患者的轉(zhuǎn)移和化療耐藥性。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)了其在40例CRC組織和相應(yīng)正常黏膜中的表達(dá)。與正常粘膜相比，miR-92a-3p在CRC組織中的表達(dá)更高。而且，與無(wú)轉(zhuǎn)移的CRC相比，有轉(zhuǎn)移的CRC中的miR-92a-3p更高。CRC組織中FBXW7和MOAP1的表達(dá)低于正常粘膜。相關(guān)分析表明，在有或沒(méi)有轉(zhuǎn)移的情況下，CRC都與miR-92a-3p與FBXW7和MOAP1呈負(fù)相關(guān)。臨床樣品檢測(cè)驗(yàn)證了5-FU / L-OHP耐藥的CRC患者的外泌體miR-92a-3p顯著更高。FBXW7和MOAP1都是miR-92a-3p的下游靶基因，外泌體miR-92a-3p可能是CRC轉(zhuǎn)移和化療耐藥的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

總結(jié): 
   CAF可以將富含miR-92a-3p的外泌體分泌到腫瘤微環(huán)境中。外泌體miR-92a-3p通過(guò)靶向CRC細(xì)胞中的FBXW7和MOAP1來(lái)促進(jìn)遷移，侵襲，轉(zhuǎn)移，干細(xì)胞和5-FU / L-OHP化療耐藥性。此外，在轉(zhuǎn)移和5-FU / L-OHP化療耐藥的CRC患者血清中，外泌體miR-92a-3p上調(diào)。我們?cè)O(shè)想，阻斷CAF分泌的外泌體miR-92a-3p的功能可以用作CRC轉(zhuǎn)移和治療耐藥性的預(yù)測(cè)和治療的替代方法。
   簡(jiǎn)而言之，結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞攝取與癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞分泌的外泌體，導(dǎo)致CRC細(xì)胞中miR-92a-3p和干性，EMT，轉(zhuǎn)移以及5-FU / L-OHP耐藥性增加。具體地說(shuō)，miR- 92a-3p通過(guò)直接結(jié)合FBXW7和MOAP1的3'UTR并抑制它們?cè)贑RC細(xì)胞中的表達(dá)，從而增強(qiáng)了侵略性和化療耐藥性。FBXW7和MOAP1的重新表達(dá)通過(guò)抑制CRC中的Wnt /β-catenin和線粒體凋亡來(lái)減弱miR-92a-3p的作用。