新發(fā)現(xiàn)-雙功能探針揭示鐵死亡伴隨?OH產(chǎn)生和細(xì)胞質(zhì)粘滯度增加

   近日，Li H等人在J Am Chem Soc發(fā)表一篇 “Ferroptosis Accompanied by OH Generation and Cytoplasmic Viscosity Increase Revealed via Dual-Functional Fluorescence Probe.”的SCI文章。他們利用自己設(shè)計(jì)的雙功能熒光探針(H-V)實(shí)現(xiàn)了鐵死亡過程中羥基自由基（?OH）產(chǎn)生和細(xì)胞粘滯度改變的同時(shí)檢測(cè)，揭示了鐵死亡伴隨著羥基自由基產(chǎn)生和細(xì)胞質(zhì)粘滯度增加。這是首次報(bào)道單個(gè)探針就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵死亡過程發(fā)生的多種變化進(jìn)行追蹤、檢測(cè)。
   Stockrop等人在2012年新提出的Ferroptosis是一種調(diào)控細(xì)胞死亡的形式，不同于caspase依賴的細(xì)胞凋亡鐵死亡的研究具有重要的生理和病理意義，因?yàn)樗赡転榧膊≈委熀退幬镌O(shè)計(jì)提供新的靈感雖然鐵死亡的分子機(jī)制和代謝途徑很復(fù)雜，但很明顯，該過程是鐵依賴性的，脂質(zhì)過氧化物的形成與活性氧（ROS）有關(guān)；脂質(zhì)過氧化物的積累是細(xì)胞死亡的主要原因。然而，尚不確定哪種ROS在鐵死亡過程中的脂質(zhì)過氧化中起關(guān)鍵作用。有證據(jù)表明，最具活性的ROS羥基（.OH）具有強(qiáng)大的氫吸收能力，能夠引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。此外，生物系統(tǒng)中。.OH的生成主要是通過Fenton反應(yīng)（Fe2++H2O2）和Haber-Weiss反應(yīng)（Fe3++O2.-），它們與鐵死亡相似，都與鐵的參與有關(guān)。因此，可以合理地假設(shè).OH的過量產(chǎn)生可能是鐵死亡中脂質(zhì)過氧化的重要原因。然而，關(guān)于該主題的研究尚未見報(bào)道，盡管在ROS熒光下觀察到總的細(xì)胞內(nèi)ROS增加，但在鐵死亡過程中.OH水平如何變化仍是未知的。例如2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA），等對(duì).OH缺乏選擇性的探針。 另一方面，細(xì)胞內(nèi)黏度是一個(gè)基本因素，或者是一些細(xì)胞過程的基礎(chǔ)，例如生物活性物質(zhì)的擴(kuò)散和信號(hào)的傳遞。某些疾病可能涉及細(xì)胞中粘度的正常變化。此外，由于細(xì)胞皺縮和細(xì)胞質(zhì)凝縮，折皺中的細(xì)胞質(zhì)粘度是細(xì)胞凋亡的重要形態(tài)學(xué)特征。由于ferroptosis在形態(tài)上與細(xì)胞凋亡不同，對(duì)于揭示鐵死亡是否伴隨細(xì)胞粘度改變具有重要意義。
   目前的熒光探針只能單獨(dú)檢測(cè)羥基自由基產(chǎn)生或細(xì)胞質(zhì)粘滯度變化。這使得檢測(cè)過程復(fù)雜，也無法準(zhǔn)確揭示羥基自由基與細(xì)胞質(zhì)粘滯度在鐵死亡過程中的關(guān)系。因此，該課題開發(fā)了熒光探針(H-V)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鐵死亡過程中羥基自由基和細(xì)胞質(zhì)粘滯度的同時(shí)成像。作者利用分子轉(zhuǎn)子策略和芳環(huán)羥基化設(shè)計(jì)出探針H-V。分子轉(zhuǎn)子有兩個(gè)對(duì)稱的小π-共軛。在分子轉(zhuǎn)子中，吲哚部分是電子受體，anisole是電子供體，它們是通過可旋轉(zhuǎn)的ethylene基鍵形成D-π-A結(jié)構(gòu)連接起來的。隨著微環(huán)境粘滯度的增加，分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受到限制，從而抑制了非輻射過程中分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致探針熒光增強(qiáng)。另一方面，芳環(huán)的羥基化被用來提高檢測(cè)?OH的選擇性，而強(qiáng)供給電子基（甲氧基）的加入能夠增強(qiáng)探針對(duì)?OH的捕獲能力，提高檢測(cè)靈敏度。此外，探針H-V中還引入了兩個(gè)磺酸鹽基團(tuán)來中和正電荷。在H-V的donor-two-acceptors結(jié)構(gòu)中，?OH造成的羥基化主要發(fā)生在甲氧基的間位上，形成Phenol intermediate，然后發(fā)生去質(zhì)子化和電子重排,最終形成一個(gè)大π共軛系統(tǒng)(圖1)。從探針H-V到product 1光譜發(fā)生很大的紅移，并且有很鮮明的近紅外熒光變化，從而實(shí)現(xiàn)用獨(dú)立的通道檢測(cè)?OH，避免了粘滯度檢測(cè)通道的交叉信號(hào)。

                                          圖1. H-V對(duì)粘滯度和羥基自由基響應(yīng)的機(jī)理

   在探針被合成出來之后，首先研究了探針H-V對(duì)粘滯度的響應(yīng)情況。探針H-V的紫外吸收在400 nm,而在520nm處有微弱的熒光發(fā)射。然后以甲醇甘油體系模擬粘滯度，研究發(fā)現(xiàn)隨著粘滯度的增加，520 nm處的熒光顯著增強(qiáng)。在純甘油中的熒光比在純甲醇中的熒光增加了50倍。這表明探針H-V對(duì)粘滯度非常敏感。隨后，隨后研究了探針H-V對(duì)?OH的響應(yīng)情況。該報(bào)道運(yùn)用Fenton反應(yīng)提供?OH。隨著Fenton試劑的增加，在652 nm處的熒光顯著增強(qiáng)，最高增強(qiáng)了450倍。而在其他活性氧的反應(yīng)中，并沒有明顯的熒光增強(qiáng)。這表明探針H-V對(duì)?OH有非常高的選擇性。

                                        圖2.探針對(duì)粘滯度和羥基自由基響應(yīng)的熒光變化

                                         圖3. HT-1080細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)粘度變化的成像

H-V適用于細(xì)胞內(nèi)?OH的獨(dú)立成像

                                       圖4. 探針對(duì)細(xì)胞質(zhì)粘滯度和羥基自由基的獨(dú)立成像

   基于圖4結(jié)果基礎(chǔ)上，此文獻(xiàn)研究了在鐵死亡過程中，探針H-V對(duì)細(xì)胞質(zhì)粘滯度和?OH的成像。通過erastin誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡，收集兩個(gè)獨(dú)立通道的熒光信號(hào)，同時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)?OH的特異性變化和粘滯度變化。隨著erastin孵育的時(shí)間增長(zhǎng)，紅色和綠色通道的熒光強(qiáng)度都增強(qiáng)，而使用鐵死亡抑制劑（DFO，F(xiàn)er-1，Lip-1）后，熒光強(qiáng)度受到顯著抑制。上述結(jié)果表明，鐵死亡伴隨著胞漿粘滯度增加和?OH生成。

                                    圖5.鐵死亡中H-V對(duì)細(xì)胞質(zhì)粘滯度和?OH的成像