作為高等生物中常見的RNA修飾方式,m6A修飾不但可以修飾mRNA,也可以修飾一些非編碼RNA,參與多種生物學(xué)過程,因此備受科研工作者的矚目。近日,一篇發(fā)表在nature communications上面的文章引起小編的注意,與大家一起來看下circRNA的m6A修飾所帶來的神奇效應(yīng)。
思維路線:
結(jié)果:
1.CircNSUN2在結(jié)腸癌(CRC)肝轉(zhuǎn)移(LM)中上調(diào)
circNSUN2源自NOP2 / Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2(NSUN2)基因座的第4和5外顯子區(qū)域,高表達(dá)circNSUN2的CRC患者總生存期(OS)較差,circNSUN2在原發(fā)性CRC,尤其是在帶LM的CRC中中常上調(diào)表達(dá)。值得注意的是,與沒有LM的CRC患者相比,circNSUN2在有LM的CRC血清中明顯上調(diào)。
2.CRC中circNSUN2的特征
circNSUN2由外顯子5至外顯子4環(huán)化形成的, 轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin d處理后,circNSUN2的半衰期超過24小時,而相關(guān)的線性轉(zhuǎn)錄本大約4小時,表明circNSUN2在CRC細(xì)胞中更穩(wěn)定。circNSUN2主要位于細(xì)胞質(zhì)中,但也出現(xiàn)在細(xì)胞核中。
3.CircNSUN2在PDX模型中促進(jìn)CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移
構(gòu)建敲低或過表達(dá)circNSUN2的TC71 PDX CRC細(xì)胞,在PDX CRC中敲除circNSUN2后,腫瘤肝臟或肺轉(zhuǎn)移明顯受到抑制,過表達(dá)circNUSN2的TC71細(xì)胞肝臟或肺中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)增加。
4.YTHDC1促進(jìn)m6A修飾的circNSUN2的細(xì)胞質(zhì)輸出
探索circNSUN2在調(diào)節(jié)CRC惡性腫瘤中潛在的分子機(jī)制,篩選circNSUN2相互作用蛋白發(fā)現(xiàn)YTHDC1和IGF2BP2是circNSUN2結(jié)合蛋白,circNSUN2可以用YTHDC1抗體沉淀,由于YTHDC1是一種m6A讀碼器,探索circNSUN2上是否有m6A甲基化,發(fā)現(xiàn)circNSUN2的外顯子5?exon 4結(jié)合區(qū)域在m6A沉淀片段高度富集,確認(rèn)circNSUN2中的m6A修飾。YTHDC1的沉默增加了核circRNA含量,相比于m6A結(jié)合缺陷型YTHDC1,野生型YTHDC1的強(qiáng)制表達(dá),挽救了YTHDC1耗盡引起circNSUN2的細(xì)胞質(zhì)輸出缺陷。YTHDC1可以結(jié)合circNSUN2,并因此以m6A依賴性方式促進(jìn)circNSUN2從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)。
5.CircNSUN2通過CAUCAU與IGF2BP2相互作用
circNSUN2能被IGF2BP2蛋白拉下來,在細(xì)胞質(zhì)中可看到circNSUN2和IGF2BP2的共定位。截短單個KH域構(gòu)建IGF2BP2突變體,發(fā)現(xiàn)IGF2BP2的KH3-4雙結(jié)構(gòu)域特異性地綁定到circNSUN2,表明KH3-4雙域負(fù)責(zé)招募circNSUN2。位于circNSUN2外顯子5-外顯子4交界處的CAUCAU基序是IGF2BP2的結(jié)合基序,是IGNS2BP2相互作用所必須的。當(dāng)IGF2BP2蛋白的濃度為增加,circNSUN2 / IGF2BP2混合物的濃度也增加,CAUCAU基序的突變可明顯降低混合物的濃度。
6.CircNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2復(fù)合物可穩(wěn)定HMGA2 mRNA
數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定了HMGA2是circNSUN2的靶標(biāo),敲除circNSUN2會降低HMGA2 mRNA的穩(wěn)定性,HMGA244的下游靶標(biāo)CXCR4的表達(dá)也被下調(diào),circNSUN2的過表達(dá)有效上調(diào)HMGA2和CXCR4的表達(dá)。因?yàn)镠MGA2可誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展,進(jìn)一步評估circNSUN2是否可以增強(qiáng)CRC細(xì)胞的EMT表型。circNSUN2的過表達(dá)導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下調(diào),間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白的表達(dá)上調(diào),提示circNSUN2通過HMGA2途徑促進(jìn)CRC細(xì)胞中的EMT。構(gòu)建野生型HMGA2-3'UTR(HMGA2-WT)或突變型3'UTR(HMGA2-Mut)熒光素酶報道基因,HMGA2-Mut中與circNSUN2交互所需的TGTTT基序已被替換。發(fā)現(xiàn)HMGA2-Mut的熒光素酶活性比HMGA2-Mut低一半,敲低circNSUN2抑制了HMGA2-WT的熒光素酶mRNA表達(dá)和熒光素酶活性,但HMGA2-Mut沒有被抑制。HMGA2和IGF2BP2共定位在細(xì)胞質(zhì)中,在circNSUN2缺失時,HMGA2 / IGF2BP2 RNA蛋白復(fù)合物減少,IGF2BP2表達(dá)保持不變。circNSUN2和HMGA2的相互作用需要IGF2BP2的 KH3-4雙結(jié)構(gòu)域。敲低circNSUN2顯著降低HMGA2 / IGF2BP2 RNA-蛋白質(zhì)相互作用,circNSUN2的過表達(dá)顯著增加了IGF2BP2免疫沉淀組分中HMGA2的富集。這些發(fā)現(xiàn)證明circNSUN2在促進(jìn)IGF2BP2和HMGA2相互作用中起關(guān)鍵作用,并增強(qiáng)的HMGA2 mRNA穩(wěn)定性,通過形成circNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2 RNA-蛋白三元復(fù)合物。
7.CircNSUN2通過HMGA2途徑促進(jìn)CRC的LM
體內(nèi)模型顯示circNSUN2敲低的 PDX CRC細(xì)胞引起的肝轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)減少,可被HMGA2過表達(dá)修復(fù),HMGA2過表達(dá)可有效抑制沉默circ NSUN2所引起的細(xì)胞侵襲遷移減少。HMGA2和CXCR4的表達(dá)水平與circNSUN2轉(zhuǎn)錄本水平為正相關(guān),HMGA2和CXCR4的表達(dá)水平預(yù)示CRC患者較差的OS。circNSUN2提供潛在的治療目標(biāo),拓寬人類CRC的治療選擇。