circRNA的m6A修飾-你值得關(guān)注

   作為高等生物中常見的RNA修飾方式，m6A修飾不但可以修飾mRNA，也可以修飾一些非編碼RNA，參與多種生物學(xué)過程，因此備受科研工作者的矚目。近日，一篇發(fā)表在nature communications上面的文章引起小編的注意，與大家一起來看下circRNA的m6A修飾所帶來的神奇效應(yīng)。

思維路線：

結(jié)果:
1.CircNSUN2在結(jié)腸癌（CRC）肝轉(zhuǎn)移（LM）中上調(diào)
   circNSUN2源自NOP2 / Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2（NSUN2）基因座的第4和5外顯子區(qū)域，高表達circNSUN2的CRC患者總生存期（OS）較差，circNSUN2在原發(fā)性CRC，尤其是在帶LM的CRC中中常上調(diào)表達。值得注意的是，與沒有LM的CRC患者相比，circNSUN2在有LM的CRC血清中明顯上調(diào)。

2.CRC中circNSUN2的特征
   circNSUN2由外顯子5至外顯子4環(huán)化形成的， 轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin d處理后，circNSUN2的半衰期超過24小時，而相關(guān)的線性轉(zhuǎn)錄本大約4小時，表明circNSUN2在CRC細胞中更穩(wěn)定。circNSUN2主要位于細胞質(zhì)中，但也出現(xiàn)在細胞核中。

3.CircNSUN2在PDX模型中促進CRC細胞轉(zhuǎn)移
   構(gòu)建敲低或過表達circNSUN2的TC71 PDX CRC細胞，在PDX CRC中敲除circNSUN2后，腫瘤肝臟或肺轉(zhuǎn)移明顯受到抑制，過表達circNUSN2的TC71細胞肝臟或肺中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)增加。

4.YTHDC1促進m6A修飾的circNSUN2的細胞質(zhì)輸出
   探索circNSUN2在調(diào)節(jié)CRC惡性腫瘤中潛在的分子機制，篩選circNSUN2相互作用蛋白發(fā)現(xiàn)YTHDC1和IGF2BP2是circNSUN2結(jié)合蛋白，circNSUN2可以用YTHDC1抗體沉淀，由于YTHDC1是一種m6A讀碼器，探索circNSUN2上是否有m6A甲基化，發(fā)現(xiàn)circNSUN2的外顯子5?exon 4結(jié)合區(qū)域在m6A沉淀片段高度富集，確認circNSUN2中的m6A修飾。YTHDC1的沉默增加了核circRNA含量，相比于m6A結(jié)合缺陷型YTHDC1，野生型YTHDC1的強制表達，挽救了YTHDC1耗盡引起circNSUN2的細胞質(zhì)輸出缺陷。YTHDC1可以結(jié)合circNSUN2，并因此以m6A依賴性方式促進circNSUN2從細胞核輸出到細胞質(zhì)。

5.CircNSUN2通過CAUCAU與IGF2BP2相互作用
   circNSUN2能被IGF2BP2蛋白拉下來，在細胞質(zhì)中可看到circNSUN2和IGF2BP2的共定位。截短單個KH域構(gòu)建IGF2BP2突變體，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2的KH3-4雙結(jié)構(gòu)域特異性地綁定到circNSUN2，表明KH3-4雙域負責(zé)招募circNSUN2。位于circNSUN2外顯子5-外顯子4交界處的CAUCAU基序是IGF2BP2的結(jié)合基序，是IGNS2BP2相互作用所必須的。當(dāng)IGF2BP2蛋白的濃度為增加，circNSUN2 / IGF2BP2混合物的濃度也增加，CAUCAU基序的突變可明顯降低混合物的濃度。

6.CircNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2復(fù)合物可穩(wěn)定HMGA2 mRNA
   數(shù)據(jù)分析和實驗驗證確定了HMGA2是circNSUN2的靶標(biāo)，敲除circNSUN2會降低HMGA2 mRNA的穩(wěn)定性，HMGA244的下游靶標(biāo)CXCR4的表達也被下調(diào)，circNSUN2的過表達有效上調(diào)HMGA2和CXCR4的表達。因為HMGA2可誘導(dǎo)EMT并促進結(jié)腸癌進展，進一步評估circNSUN2是否可以增強CRC細胞的EMT表型。circNSUN2的過表達導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白的表達上調(diào)，提示circNSUN2通過HMGA2途徑促進CRC細胞中的EMT。構(gòu)建野生型HMGA2-3'UTR（HMGA2-WT）或突變型3'UTR（HMGA2-Mut）熒光素酶報道基因，HMGA2-Mut中與circNSUN2交互所需的TGTTT基序已被替換。發(fā)現(xiàn)HMGA2-Mut的熒光素酶活性比HMGA2-Mut低一半，敲低circNSUN2抑制了HMGA2-WT的熒光素酶mRNA表達和熒光素酶活性，但HMGA2-Mut沒有被抑制。HMGA2和IGF2BP2共定位在細胞質(zhì)中，在circNSUN2缺失時，HMGA2 / IGF2BP2 RNA蛋白復(fù)合物減少，IGF2BP2表達保持不變。circNSUN2和HMGA2的相互作用需要IGF2BP2的 KH3-4雙結(jié)構(gòu)域。敲低circNSUN2顯著降低HMGA2 / IGF2BP2 RNA-蛋白質(zhì)相互作用，circNSUN2的過表達顯著增加了IGF2BP2免疫沉淀組分中HMGA2的富集。這些發(fā)現(xiàn)證明circNSUN2在促進IGF2BP2和HMGA2相互作用中起關(guān)鍵作用，并增強的HMGA2 mRNA穩(wěn)定性，通過形成circNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2 RNA-蛋白三元復(fù)合物。

7.CircNSUN2通過HMGA2途徑促進CRC的LM
   體內(nèi)模型顯示circNSUN2敲低的 PDX CRC細胞引起的肝轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)減少，可被HMGA2過表達修復(fù)，HMGA2過表達可有效抑制沉默circ NSUN2所引起的細胞侵襲遷移減少。HMGA2和CXCR4的表達水平與circNSUN2轉(zhuǎn)錄本水平為正相關(guān)，HMGA2和CXCR4的表達水平預(yù)示CRC患者較差的OS。circNSUN2提供潛在的治療目標(biāo)，拓寬人類CRC的治療選擇。