m6A甲基化與肝癌之間的奧秘

m6A甲基化與肝癌之間的奧秘

    m6A甲基化是一種眾所周知的具有表觀遺傳新功能的修飾，有報(bào)道稱其參與了肝癌（HCC）的發(fā)生，為該疾病的分子發(fā)病機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。然而，作為m6A甲基化的關(guān)鍵成分，WTAP在HCC中尚未得到很好的研究。在此，我們研究了WTAP在肝癌中的生物學(xué)作用及其機(jī)制.

本文利用組織芯片和TCGA數(shù)據(jù)集檢測(cè)WTAP的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、菌落形成實(shí)驗(yàn)、Edu化驗(yàn)和皮下異種移植實(shí)驗(yàn)，闡明了WTAP對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。另外，利用RNA測(cè)序結(jié)合GEO數(shù)據(jù)篩選WTAP候選靶點(diǎn)。最后，我們通過(guò)m6A點(diǎn)印記法、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、RNA免疫沉淀（RIP）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）等方法研究了WTAP在HCC中的調(diào)控機(jī)制。

結(jié)果：

1.    WTAP過(guò)表達(dá)與肝癌預(yù)后不良有關(guān)

為了闡明WTAP的作用，我們首先從GEO數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)中分析了WTAP在人HCC樣本中的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示WTAP在腫瘤組織中的表達(dá)顯著增高（圖1a）。WTAP蛋白水平在HCC組織中也明顯上調(diào)（圖1b），經(jīng)TMA隊(duì)列IHC染色進(jìn)一步證實(shí)（圖1c，d）。此外，探討了90例HCC患者WTAP表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。Kaplan-Meier分析顯示，WTAP表達(dá)水平越高的患者總體生存率（OS）和無(wú)病生存率（DFS）越低（圖1e）。而且WTAP的過(guò)表達(dá)被發(fā)現(xiàn)是HCC患者的OS 和DFS 的獨(dú)立預(yù)后因素（圖1f）。綜上所述，我們的結(jié)論是WTAP在HCC中上調(diào)，并與其不良預(yù)后密切相關(guān)。

2.  WTAP在體內(nèi)外均能促進(jìn)腫瘤的增殖和致瘤能力

CCK-8和集落形成試驗(yàn)表明，WTAP缺乏抑制了三種細(xì)胞系（Huh7，Hep3B，PLC/PRF/5）的增殖能力（圖2 a-c）。此外，EdU分析暗示敲低WTAP會(huì)減緩細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2 d）。

為了證實(shí)WTAP在體內(nèi)的作用，我們通過(guò)皮下注射HCC細(xì)胞，在裸鼠體內(nèi)穩(wěn)定敲低（shWTAP #1， #3）或過(guò)表達(dá)WTAP （WTAP- oe），構(gòu)建了腫瘤異種移植模型。我們發(fā)現(xiàn)WTAP損耗抑制腫瘤發(fā)生（圖2 e），顯著降低腫瘤體積和重量（圖2 f，g）。與此同時(shí)，WTAP的強(qiáng)迫表達(dá)導(dǎo)致異種移植小鼠的表型逆轉(zhuǎn)（圖2h-j）。綜上所述，我們認(rèn)為WTAP在HCC中具有腫瘤促進(jìn)作用。

3.ETS1被認(rèn)為是HCC中WTAP的潛在靶點(diǎn)

為了了解WTAP在HCC中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用的潛在機(jī)制，我們采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)闡明WTAP敲除細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變。WTAP缺失后，層次聚類顯示上調(diào)基因1636個(gè)，下調(diào)基因794個(gè)（圖3a）。為了縮小下游靶點(diǎn)的范圍，我們整合Liu等人發(fā)表的GEO數(shù)據(jù)（GSE46705）。通過(guò)MeRIP -seq和CLIP-seq對(duì)WTAP調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行精化，建立基因集重疊。維恩圖共揭示了15個(gè)基因（圖3b）。然后我們進(jìn)行RT-qPCR來(lái)評(píng)估WTAP對(duì)每個(gè)候選基因的影響。其中，在WTAP沉默后，ETS1和ETS2持續(xù)顯著上調(diào)，當(dāng)WTAP過(guò)表達(dá)時(shí)，ETS1和ETS2均適度下調(diào)（圖3c-e）。然而，western blot分析顯示，WTAP失活明顯導(dǎo)致ETS1蛋白水平升高，而不是ETS2蛋白水平升高（圖3f，g）。接著我們進(jìn)一步證明，在Hep3B和HCCLM3細(xì)胞中，WTAP對(duì)ETS1的含量有相反的影響（圖3h，i）。因此，我們推測(cè)ETS1功能障礙可能是WTAP介導(dǎo)的HCC增殖特征的原因。

4. WTAP增加了ETS1 mRNA的m6A修飾，并以m6A-HuR介導(dǎo)的方式抑制ETS1的表達(dá)

為了確定ETS1的m6A修飾是否通過(guò)WTAP介導(dǎo)，我們首先通過(guò)兩種不同的方法（m6A斑點(diǎn)印跡法和RNA甲基化定量法）檢測(cè)陰性對(duì)照組和穩(wěn)定的WTAP敲低組的m6A的整體水平。結(jié)果表明，隨著WTAP的缺失，兩株HCC細(xì)胞系m6A水平顯著降低（圖4a，b）。通過(guò)MeRIP-qPCR檢測(cè)m6A在ETS1中的富集情況。發(fā)現(xiàn)與IgG對(duì)照相比，m6A特異性抗體較強(qiáng)地富集了ETS1轉(zhuǎn)錄本。此外，我們發(fā)現(xiàn)在WTAP沉默后，m6A修飾的ETS1顯著減少（圖4c）。因此，我們認(rèn)為WTAP能夠影響m6A的總體水平，尤其是ETS1。

為了證實(shí)m6A修飾ETS1的要求，我們用野生型（WT）和兩個(gè)突變體（Mut）質(zhì)粒進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。對(duì)于Mut報(bào)告基因，預(yù)測(cè)m6A位點(diǎn)的幾個(gè)腺苷堿基（A）被胞嘧啶堿基（C）取代，以消除m6A甲基化的影響，而WT報(bào)告基因包含完整的m6A位點(diǎn)（圖4d）。正如所料，WT組的熒光素酶活性在WTAP敲低作用下適度增強(qiáng)，而Mut組的熒光素酶活性對(duì)WTAP沉默的影響具有一定的抵抗作用（圖4e），說(shuō)明ETS1的調(diào)控受WTAP誘導(dǎo)的m6A修飾的控制?？傊@些數(shù)據(jù)表明WTAP足以調(diào)控ETS1 mRNA的m6A修飾。

RNA結(jié)合蛋白HuR易于與較少的m6A修飾的RNA結(jié)合，并穩(wěn)定其結(jié)合的對(duì)應(yīng)物，因此我們認(rèn)為HuR可能調(diào)控ETS1。結(jié)果表明，HuR的減少顯著減輕了ETS1的表達(dá)（圖4f）。我們發(fā)現(xiàn)，與IgG對(duì)照組相比，HuR特異性抗體顯著富集ETS1 mRNA，而WTAP的抑制顯著增強(qiáng)了ETS1 mRNA的富集（圖4g）。此外，WTAP敲低引起的ETS1升高可以通過(guò)HuR的衰減來(lái)恢復(fù)（圖4h）。我們還發(fā)現(xiàn)，敲除WTAP可以延長(zhǎng)ETS1 RNA的半衰期，而HuR沉默可以逆轉(zhuǎn)這種效果（圖4i）。最后，我們還進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，以確定HuR參與m6A的修飾。在WT組中，HuR可以挽救WTAP沉默引起的熒光素酶活性的增強(qiáng)。然而，當(dāng)ETS1的m6A位點(diǎn)可能發(fā)生突變時(shí)，HuR表達(dá)的改變似乎對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有影響（圖4j）?？傊?，我們的發(fā)現(xiàn)表明WTAP通過(guò)m6A- HuR依賴的通路抑制ETS1。

5. ETS1作為一種腫瘤抑制因子，逆轉(zhuǎn)了WTAP在HCC中的作用

與癌旁組織相比，腫瘤組織中ETS1的表達(dá)較低（圖5a，b）。通過(guò)對(duì)cohort1的免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)鄰近組織的陽(yáng)性率明顯較高（圖5c，d）。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)，ETS1水平越高，預(yù)后越好（圖5e）。體外功能驗(yàn)證表明，ETS1的敲除增強(qiáng)了MHCC97H、HCCLM3和Huh7細(xì)胞的增殖能力（圖5f，g）。此外，ETS1沉默足以挽救WTAP敲低對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的抑制作用（圖5h，i），因此ETS1的失活可能通過(guò)WTAP-ETS1軸導(dǎo)致HCC的進(jìn)展。

6. WTAP的沉默通過(guò)ETS1-p21/p27軸在HCC中引起G2/M阻滯

據(jù)報(bào)道WTAP參與細(xì)胞周期調(diào)控，因此我們擬探討其在HCC中的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，WTAP敲低導(dǎo)致了G2/M的大量阻滯（圖6a，b）。為了闡明潛在的機(jī)制，我們研究了與細(xì)胞周期相關(guān)的幾個(gè)元素。有趣的是，當(dāng)WTAP在轉(zhuǎn)錄水平失活時(shí)，在細(xì)胞周期和增殖中發(fā)揮重要作用的腫瘤抑制因子p21和p27的表達(dá)顯著增加（圖6c、d）。同時(shí)，western blot分析發(fā)現(xiàn)WTAP敲低上調(diào)了p21和p27，同時(shí)下調(diào)了CDC25C、CDK1、cyclin-A2和cyclin-B1。相反，WTAP的過(guò)表達(dá)減輕了p21和p27的表達(dá)，降低了G2期所有指示的檢查點(diǎn)蛋白的放大（圖6e）。

為了進(jìn)一步研究ETS1是否參與WTAP誘導(dǎo)的細(xì)胞周期效應(yīng)，我們進(jìn)行了一系列的挽救性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明抑制ETS1可顯著逆轉(zhuǎn)WTAP沉默引起的G2/M阻滯（圖6f）。此外，ETS1的下調(diào)導(dǎo)致p21和p27的減少（圖6h）。而且我們推測(cè)ETS1可能增強(qiáng)p21和p27的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)镃hIP實(shí)驗(yàn)表明ETS1可以與啟動(dòng)子結(jié)合（圖6i）。此外，ETS1的抑制恢復(fù)了WTAP抑制引起的p21和p27表達(dá)升高（圖6j，k），這些數(shù)據(jù)表明ETS1-p21/p27軸在HCC中對(duì)WTAP依賴的細(xì)胞周期調(diào)控至關(guān)重要。

7.結(jié)合高WTAP和低ETS1表達(dá)預(yù)測(cè)肝癌的不良預(yù)后

為了評(píng)估WTAP和ETS1的臨床相關(guān)性，我們對(duì)來(lái)自cohort1的相同HCC標(biāo)本進(jìn)行了WTAP和ETS1染色的IHC檢測(cè)。近65.2%的高WTAP表達(dá)的樣本ETS1染色較弱，而大約55.6%的低WTAP表達(dá)的樣本表現(xiàn)出更強(qiáng)的ETS1染色（圖6a，b）?；谶@兩種因素結(jié)合的Kaplan-Meier分析進(jìn)一步證明，WTAPhighETS1low表達(dá)的HCC患者的總體生存率比其他任何組都要低（圖7c）。綜上所述，WTAP與ETS1在臨床樣本中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，WTAP與ETS1的共表達(dá)模式可能是判斷HCC預(yù)后的一個(gè)有效因素。

總結(jié)：

總之，我們的研究闡明了WTAP和活化的WTAP介導(dǎo)的m6A機(jī)制在HCC中的致癌作用。WTAP上調(diào)參與了ETS1的m6A修飾，隨后通過(guò)HuR關(guān)聯(lián)的方式使ETS1表觀遺傳沉默。我們的發(fā)現(xiàn)豐富了腫瘤特征中m6A甲基化的功能價(jià)值，為探索肝癌治療中有效的治療策略開(kāi)辟了潛在的途徑。