lncRNA通過ceRNA機(jī)制靶向Mir26a調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)心肌損傷

lncRNA通過ceRNA機(jī)制靶向Mir26a調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)心肌損傷

lncRNA在多種生物學(xué)過程中充當(dāng)調(diào)控因子的作用，但是他在急性心肌梗塞（AMI）中的作用尚不清楚。今年九月剛發(fā)表在影響因子11.059的Autophagy雜志上的一篇文章探索了這一過程，并發(fā)現(xiàn)了lncRNA 2810403D21Rik/Mirf通過靶向Mir26a的ceRNA機(jī)制作為抗自噬分子發(fā)揮作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、Mir26a在心肌梗死中的心臟保護(hù)作用:自噬的作用

在心肌梗塞（MI）的小鼠模型中Mir26a表達(dá)下調(diào)（圖1A）；類似的，使用雙氧水處理后的小鼠Mir26a表達(dá)也下調(diào)（圖1B）；沉默表達(dá)Mir26a降低了自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量（圖1C）；并且LC3-II的表達(dá)下降，而SQSTM1/p62的表達(dá)升高（圖1 D）。作者構(gòu)建了Mir26a的海綿轉(zhuǎn)基因小鼠模型，顯著降低小鼠內(nèi)源性Mir26a的表達(dá)（圖1E），并降低了射血分?jǐn)?shù)和分?jǐn)?shù)縮短 (Figure 1F)，這表明Mir26a敲除損傷了小鼠的左心室功能。此外，Mir26a敲除阻礙了自噬體形成導(dǎo)致心臟中自噬反應(yīng)下降（圖1G）。

圖1敲低Mir26a會減少自噬而損害心臟功能

另一方面，Mir26a的過表達(dá)減輕了雙氧水對新生小鼠心肌細(xì)胞（NMCMs）的細(xì)胞活力的抑制作用，這種抑制作用被自噬拮抗劑3-MA所消除（圖2 A）；過表達(dá)Mir26a促進(jìn)了自噬體的形成以及自噬體-溶酶體的融合，但3-MA可抑制這個(gè)作業(yè)（圖2B）；過表達(dá)Mir26a可改善心肌梗死模型小鼠的心臟功能，縮小梗死面積（圖2C和D）；透射電鏡觀察到Mir26a對心肌梗死小鼠自噬的促進(jìn)作用(圖2 E)。WB顯示，過表達(dá)Mir26a可以促進(jìn)MI小鼠自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖2F)。

圖2 Mir26a的強(qiáng)制表達(dá)通過激活自噬保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷

2、Mir26a心臟保護(hù)作用的信號機(jī)制:對Usp15的鎮(zhèn)壓

Targetscan預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)編碼Usp15的基因包含了Mir26a的種子序列，該基因在人類、小鼠和大鼠中具有廣泛的保守性（圖3A）；有報(bào)道稱Usp15拮抗患者成纖維細(xì)胞的線粒體吞噬作用，但作者發(fā)現(xiàn)在MI心臟的邊緣區(qū)域和暴露于雙眼水的心肌細(xì)胞中Usp15上調(diào)表達(dá)（圖3B和C）。共轉(zhuǎn)染Mir26a后，只有攜帶WT Usp15結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶載體或結(jié)合位點(diǎn)1突變的熒光素酶載體(mut-1)表現(xiàn)出熒光素酶活性抑制 (圖3D)。Mir26a降低了USP15蛋白的水平，但AMO-26a卻提高了USP15蛋白的水平，盡管它們均未影響Usp15的轉(zhuǎn)錄（圖3E和F）。Mir26a KD小鼠中USP15的表達(dá)增加（圖3G）。在NMCM中過表達(dá)Mir26a抑制了SQSTM1 / p62的表達(dá)，并促進(jìn)了LC3-II，ATG7，ECN1 / Beclin1和ATG5的表達(dá)（圖3H）。

圖3 Usp15是Mir26a的直接靶標(biāo)

4、LncRNA 2810403D21Rik/Mirf能夠結(jié)合并調(diào)控Mir26a的活性

使用miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測到候選的lncRNA AK007586，qRT-PCR顯示它在MI模型小鼠中顯著上調(diào)，將其命名為2810403D21Rik/Mirf，定位于細(xì)胞質(zhì)（圖4A和C）；在雙氧水刺進(jìn)的NMCM中2810403D21Rik/Mirf的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4B）；過表達(dá)2810403D21Rik/Mirf抑制Mir26a的表達(dá)，沉默則相反（圖4D和E）；熒光素酶實(shí)驗(yàn)得出類似的結(jié)論（圖4F-I）；親和分離實(shí)驗(yàn)表明，2810403D21Rik/Mirf與AGO2相互作用(圖4J)。心肌細(xì)胞用生物素化的Mir26a轉(zhuǎn)染，然后以生物素為基礎(chǔ)做親和力分離試驗(yàn)，其中通過qRT-PCR（圖4L）和瓊脂糖凝膠電泳（圖4M）表明Mir26a可以拉下2810403D21Rik / Mirf，并且Mir26a對2810403D21Rik / Mirf的識別是序列特異性的。這些結(jié)果表明2810403D21Rik / Mirf與Mir26a和AGO2直接相互作用形成RISC并調(diào)節(jié)Mir26a的表達(dá)和活性。

圖4 LncRNA 2810403D21Rik/Mirf調(diào)控Mir26a的表達(dá)和活性

5、LncRNA 2810403D21Rik/Mirf通過Mir26a-Usp15軸調(diào)節(jié)自噬

2810403D21Rik/Mirf限制了Mir26a/Usp15軸的功能，從而抑制自噬，通過減輕內(nèi)在的心臟保護(hù)活性而導(dǎo)致心肌損傷

圖5 2810403D21Rik/Mirf通過調(diào)節(jié)Mir26a和Usp15調(diào)節(jié)自噬，促進(jìn)NMCMs的心臟損傷

如圖6所示， 2810403D21Rik/Mirf沉默通過激活Mir26a和自噬保護(hù)雙氧水誘導(dǎo)的心肌損傷。

圖6抑制2810403D21Rik / Mirf可以通過增加Mir26a的自噬調(diào)節(jié)來拮抗NMCM中雙氧水誘導(dǎo)的損傷。

如圖7所示，f-2810403D21Rik/Mirf可以模擬2810403D21Rik/Mirf對自噬和細(xì)胞損傷的作用，說明Mir26a結(jié)合位點(diǎn)是2810403D21Rik/Mirf的功能域。

圖7 f-2810403D21Rik/Mirf的過表達(dá)通過抑制內(nèi)源性Mir26a在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中引起心肌損傷

6、沉默2810403D21Rik/Mirf可以減輕心肌損傷，保護(hù)心肌梗死小鼠的心臟功能

如圖8所示，2810403D21Rik/Mirf的沉默可調(diào)節(jié)自噬，對缺血性心功能損害具有保護(hù)作用。

圖8 在MI小鼠模型中沉默2810403D21Rik / Mirf可減輕心肌損傷并保護(hù)心臟功能

簡而言之，本文鑒定了一種新型的抗自噬lncRNA 2810403D21Rik / Mirf，它通過ceRNA機(jī)制來調(diào)節(jié)Mir26a的水平，從而加劇了缺血性心臟損傷。因此，調(diào)節(jié)2810403D21Rik / Mirf的表達(dá)可能是預(yù)防和治療AMI的新方法。