原發(fā)性前列腺癌通過(guò)外泌體丙酮酸激酶 M2 促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移

原發(fā)性前列腺癌通過(guò)外泌體丙酮酸激酶 M2 促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移

9月份，Jinlu Dai等人發(fā)表一篇“Primary prostate cancer educates bone stroma through exosomal pyruvate kinase M2 to promote bone metastasis.”的SCI文章，IF= 10.892，這項(xiàng)研究確定PCa 衍生的外泌體是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境來(lái)促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移，并確定實(shí)現(xiàn)該目的的機(jī)制。

骨轉(zhuǎn)移是許多轉(zhuǎn)移性癌癥的常見后遺癥。在患有晚期前列腺癌（PCa）的男性中，骨骼是最常見的轉(zhuǎn)移靶標(biāo)。大約84％的男性會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移；而最常見的軟組織轉(zhuǎn)移部位，即肝臟在體重不太嚴(yán)重的男性中很少見治療后骨轉(zhuǎn)移，發(fā)生率低得多（?65％）.與軟組織轉(zhuǎn)移相比，促進(jìn) PCa 更頻繁地發(fā)展為臨床可檢測(cè)的骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確。轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及成功建立臨床上有意義的轉(zhuǎn)移的多個(gè)步驟。廣義上講，增加的骨特異性可能是由于轉(zhuǎn)移性細(xì)胞相對(duì)于軟組織部位向骨骼的播種增加和/或骨骼微環(huán)境比軟組織部位更有效地促進(jìn) PCa 生長(zhǎng)的能力。這些概念反映了Stephen Paget的“種子和土壤”理論，表明癌細(xì)胞與遠(yuǎn)處微環(huán)境的某些組合可以優(yōu)化癌細(xì)胞的生長(zhǎng)機(jī)會(huì).但是，該理論并不要求在腫瘤生長(zhǎng)之前就存在最佳的微環(huán)境。

因此，腫瘤可以利用來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的一種策略是改變遠(yuǎn)處的微環(huán)境以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的接種或腫瘤的生長(zhǎng)。幾份報(bào)告表明，原發(fā)腫瘤釋放的外泌體可以修飾遠(yuǎn)處，以促進(jìn)這些部位的轉(zhuǎn)移.外泌體是在 30-120 nm 范圍內(nèi)的膜結(jié)合囊泡，在多囊泡體內(nèi)合成，并在多囊泡體與細(xì)胞膜融合后從細(xì)胞釋放.外泌體包含多種生物分子，包括蛋白質(zhì)， mRNA， lncRNA和 microRNA，它們可能會(huì)影響遠(yuǎn)處的細(xì)胞功能。因此，來(lái)自原發(fā)腫瘤的外泌體可能能夠遞送改變遠(yuǎn)處的生物分子，從而使其具有促進(jìn)轉(zhuǎn)移的能力。此過(guò)程定義為“轉(zhuǎn)移前的niche”的創(chuàng)建。

技術(shù)路線：

一、前期準(zhǔn)備工作

A.評(píng)估PCa外泌體是否影響影響轉(zhuǎn)移過(guò)程，從PCa細(xì)胞系中收獲外泌體，并對(duì)外泌體進(jìn)行表征。從PC-3和C4-2B PCa細(xì)胞由基于電子顯微鏡代表性圖片。微囊泡的最大范圍為300 nm，并且大多數(shù)表達(dá)CD9，ALIX，和HSP70蛋白。

B.運(yùn)用 NanoSight確定外泌體定大小分布。

C和D. 使用 Nanosight 測(cè)定每毫升來(lái)自C4-2B 或 PC3 條件下培養(yǎng)基和人類受試者的血清的外泌體數(shù)量。對(duì)外泌體蛋白質(zhì)marker進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

一、PCa 衍生的外泌體促進(jìn)小鼠骨骼中的腫瘤生長(zhǎng)

A. 用外泌體對(duì)SCID小鼠進(jìn)行預(yù)處理，隨后將PCa 細(xì)胞進(jìn)行心內(nèi)（ic）注射（左心室），并連續(xù)處理外泌體 21 天。與媒介物相比，PCa 外泌體誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)移部位數(shù)量的增加和總腫瘤負(fù)荷的增加。用 C4-2B 衍生的外泌體（A）或完全培養(yǎng)基的外泌體進(jìn)行預(yù)處理 4 d，然后 ic 注射 PC3-熒光素酶細(xì)胞，連續(xù)外泌體治療 21 d。

B. 為了確定 PCa 患者的外泌體是否影響 PCa 轉(zhuǎn)移，我們使用健康男人血清與原發(fā)性 PCa 腫瘤患者的外泌體重復(fù)了 PCa小鼠模型實(shí)驗(yàn)。與健康男性相比，患有原發(fā)性 PCa 腫瘤的男性的外泌體增加了轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)的總數(shù)。

C. 我們用 PCa 外泌體預(yù)處理小鼠 4 d，將 PCa 細(xì)胞注入左心室，然后在 24 小時(shí)后收獲骨髓，以定量接種骨髓的 PCa 細(xì)胞。與媒介物處理相比，用 PCa 外泌體進(jìn)行預(yù)處理可使骨髓中 PCa 細(xì)胞的播種量增加約 115％.

補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)結(jié)果：外源性外泌體對(duì) PCa 的生長(zhǎng)沒有影響。

D. 我們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了工程改造以表達(dá)熒光標(biāo)記的將工程改造為表達(dá)熒光外泌體的 PCa細(xì)胞注射到受體小鼠的前列腺中，并于 3 周后評(píng)估了骨髓基質(zhì)中的外泌體。注射腫瘤細(xì)胞后第 3 周，骨髓基質(zhì)中存在外泌體。我們最初將這些外泌體靜脈內(nèi)注射入小鼠體內(nèi)，并在 24小時(shí)內(nèi)鑒定出它們?cè)诠撬杌|(zhì)細(xì)胞（BMSC）中的存在。

E. 將工程改造為表達(dá)熒光外泌體的 PCa細(xì)胞注射到受體小鼠的前列腺中，并于 3 周后評(píng)估了骨髓基質(zhì)中的外泌體。注射腫瘤細(xì)胞后第 3 周，骨髓基質(zhì)中存在外泌體.

F.為了排除熒光是否是由于癌細(xì)胞在該時(shí)間點(diǎn)擴(kuò)散所致，我們使用 PCR 對(duì) Alu 序列進(jìn)行了評(píng)估，評(píng)估了骨髓中人類細(xì)胞的存在.在任何骨髓樣本中均未發(fā)現(xiàn) Alu，這表明該時(shí)間點(diǎn)沒有人類細(xì)胞存在.

G. PCa 有轉(zhuǎn)移到骨骼的傾向。然而，它確實(shí)轉(zhuǎn)移到其他部位（例如肝臟），盡管頻率較低。為了確定 PCa 外泌體是否除了骨骼外還靶向軟組織部位，我們?cè)谛∈笾徐o脈注射了熒光標(biāo)記的 PCa 外泌體，并在 24 h 評(píng)估了腎臟，腦，肝，肺和骨髓的外泌體。外泌體存在于所有組織中。但是，在每個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，它們靶向骨髓基質(zhì)的水平高于其他組織.

綜上所述，這些結(jié)果表明， PCa 外泌體對(duì) PCa 細(xì)胞沒有直接影響，而是通過(guò)遙遠(yuǎn)的靶微環(huán)境間接靶向和促進(jìn) PCa進(jìn)程，并具有針對(duì)骨髓的選擇性。來(lái)自 PCa 細(xì)胞系條件培養(yǎng)基的外泌體，一旦在體內(nèi)注射后，可能會(huì)被修飾以直接對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生影響，但這不太可能，因?yàn)?PCa 患者的外泌體包括體內(nèi)–衍生的外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有直接影響，但是它們確實(shí)對(duì)體內(nèi)有影響。

二、PCa 衍生的外泌體教育骨基質(zhì)細(xì)胞增加 PCa 腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲

A. 評(píng)估了外泌體改變 BMSC 影響PCa 細(xì)胞生長(zhǎng)的能力的程度。像以前一樣， PCa 外泌體對(duì) PCa 細(xì)胞沒有直接作用。但是，未經(jīng)處理的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基會(huì)抑制 PCa 細(xì)胞的生長(zhǎng)。相反，用外泌體預(yù)處理的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基（源自 PCa 細(xì)胞或 PCa 患者血清）可增加 PCa 細(xì)胞的生長(zhǎng)

B. 將 PCa 細(xì)胞皮下植入了沒有基質(zhì)細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞的膠原海綿中小鼠相反側(cè)面的細(xì)胞，然后用運(yùn)載體或 PCa 外泌體處理小鼠。單獨(dú)的外泌體和單獨(dú)的基質(zhì)細(xì)胞都不會(huì)影響 PCa 的生長(zhǎng)，而在充滿基質(zhì)細(xì)胞的海綿中，外泌體誘導(dǎo) PCa 的生長(zhǎng)

C. PCa 外泌體影響內(nèi)皮細(xì)胞，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞調(diào)節(jié) PCa 生長(zhǎng)的能力。外泌體在成纖維細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞中作用最強(qiáng)，其次是成骨細(xì)胞，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞或破骨細(xì)胞沒有影響

D. 外泌體對(duì) PCa 細(xì)胞侵襲特性的影響。基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基單獨(dú)促進(jìn) PCa 侵襲。然而，來(lái)自 PCa 細(xì)胞外泌體預(yù)處理的基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)一步提高了 PCa 細(xì)胞的侵襲能力。

三、PCa 衍生的外泌體增加基質(zhì)細(xì)胞中丙酮酸激酶 M2

A. 為了驗(yàn)證外泌體調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞 PKM2 表達(dá)，將基質(zhì)細(xì)胞暴露于外泌體，并評(píng)估 PKM2 蛋白表達(dá)。PCa 外泌體增加了 ST2細(xì)胞和原代 BMSCs 中 PKM2 蛋白的表達(dá)。

B. PCa患者的外泌體增加了 ST2 細(xì)胞和原代 BMSCs 中 PKM2 蛋白的表達(dá)。

C. 與基質(zhì)細(xì)胞中 PKM2 蛋白的增加相反，基質(zhì)細(xì)胞中外泌體不會(huì)改變 PKM2 mRNA 的表達(dá)。

D. 我們發(fā)現(xiàn)用含有人 PKM2 的外來(lái)體處理基質(zhì)細(xì)胞會(huì)增加基質(zhì)細(xì)胞中人 PKM2 的表達(dá).

E. 當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞用衍生自 PCa 細(xì)胞的外泌體處理時(shí)，人PKM2 沒有增加，其中 PKM2 被敲低。此外，當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞用衍生自 PCa 細(xì)胞的外泌體處理后，小鼠 PKM2并未增加，其中 PKM2 被敲除. 綜上所述，外泌體將 PKM2 蛋白轉(zhuǎn)移到基質(zhì)細(xì)胞，而不是誘導(dǎo) PKM2 mRNA 合成或蛋白合成。

F. 表明外泌體將 PKM2 蛋白轉(zhuǎn)移到基質(zhì)細(xì)胞，而不是誘導(dǎo) PKM2 mRNA 合成或蛋白合成

接下來(lái)，確定 PKM2 是否可以解釋外泌體調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞以促進(jìn) PCa 生長(zhǎng)的能力。

A. PKM2 的敲低導(dǎo)致外泌體缺乏PKM2。補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)：PKM2 不會(huì)影響外泌體的產(chǎn)生。

B. 缺乏PKM2的外泌體不會(huì)改變ST2基質(zhì)細(xì)胞中PKM2蛋白的表達(dá)。

C. 將癌細(xì)胞系與基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基一起培養(yǎng)，該基質(zhì)來(lái)自用缺乏 PKM2 的外泌體處理的基質(zhì)細(xì)胞。PCa 外泌體中 PKM2 表達(dá)增加導(dǎo)致喪失PCa 外泌體誘導(dǎo) PCa 細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。

D. 敲除 PKM2 是否會(huì)影響原位原位腫瘤的生長(zhǎng)。注射腫瘤細(xì)胞后第 14 天，安樂(lè)死每組小鼠的一部分，并測(cè)量腫瘤大小。在對(duì)照組和PKM2 基因敲低的 PCa 細(xì)胞之間，原位腫瘤的大小沒有差異。

E和F. 原發(fā)性原位腫瘤的存在（由對(duì)照加擾的 shRNA 細(xì)胞組成）增加了轉(zhuǎn)移的數(shù)量和總體轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)。然而，在原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中 PKM2 的敲低 部分減弱了原發(fā)性腫瘤增加轉(zhuǎn)移數(shù)目和轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)的能力。這些結(jié)果證明原發(fā)性前列腺腫瘤促進(jìn)轉(zhuǎn)移，而 PKM2 促進(jìn)原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果與原發(fā)性腫瘤可以部分通過(guò)外泌體 PKM2 促進(jìn)轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)相一致。

四、PCa 外泌體通過(guò) PKM2 誘導(dǎo)的 BMSC 通過(guò) CXCL12 促進(jìn)PCa 腫瘤生長(zhǎng)

目的：探討 PCa 外泌體中的 PKM2 是否調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生可溶因子以促進(jìn) PCa 生長(zhǎng)

A. PKM2 敲低改變了幾種細(xì)胞因子的表達(dá)；然而，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4（BMP-4）和 CXCL12 的表達(dá)明顯降低。

B. PCa 衍生的外泌體誘導(dǎo)CXCL12 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)超過(guò) 13 倍，而敲除 PCa 外泌體中的 PKM2 降低了 PCa 衍生的外泌體誘導(dǎo) CXCL12 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的能力。

C. PCa衍生的外泌體誘導(dǎo) BMP-4 mRNA 的表達(dá)少于 1 倍，盡管PCa 衍生的外泌體中 PKM2 的敲低降低了 PCa 衍生的外泌體誘導(dǎo) BMP-4 mRNA 表達(dá)的能力。

確定 PCa 外泌體培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞是否通過(guò) CXCL12 促進(jìn) PCa 細(xì)胞生長(zhǎng)

AMD3100：抑制CXCL12 結(jié)合其靶標(biāo)

A和B. 來(lái)自 PCa 的外來(lái)體處理過(guò)的基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增加了 PC3 和 C4-2B 細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。但是，AMD3100 取消了對(duì)增殖和入侵的誘導(dǎo)。

C和D. 來(lái)自 PCa 的外來(lái)體處理過(guò)的基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增加了 PC3 和 C4-2B 細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。但是，AMD3100 取消了對(duì)增殖和入侵的誘導(dǎo)。

E. PCa 衍生的外泌體增加了 PCa 植入骨髓的能力，AMD3100 減少了 PC-3 細(xì)胞的接種。

F和G．PCa 衍生的外泌體增加了 C4-2B 和 PC-3 腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移數(shù)量和總轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)，而 AMD3100 抑制了這些作用.

H. 為了進(jìn)一步確認(rèn)這些結(jié)果是通過(guò) CXCL12： CXCR4信號(hào)軸介導(dǎo)的，我們敲低了 PC-3 細(xì)胞中 CXCR4 的表達(dá).

I和J. PC-3 細(xì)胞中 CXCR4 的敲低減少了外來(lái)體誘導(dǎo)的接種以及轉(zhuǎn)移的數(shù)量和總轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān).綜上所述，這些結(jié)果表明外泌體含有 PKM2，它可以刺激基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生 CXCL12，從而促進(jìn) PCa 轉(zhuǎn)移的進(jìn)展.

A-C. 確定外泌體是否促進(jìn)了 HIF-1α 表達(dá)，并且這是否依賴于 PKM2。PC 衍生的外泌體刺激了 ST2 基質(zhì)細(xì)胞系和原代鼠 BMSCs 中的 HIF- 1αmRNA 和蛋白表達(dá)，而 PCa 衍生的外泌體中的 PKM2 敲低顯著降低了 HIF-1αmRNA 和蛋白表達(dá)的誘導(dǎo).

D. PCa 衍生的外來(lái)體以 PKM2 依賴的方式促進(jìn) HIF-1α 表達(dá)。為了確定外泌體誘導(dǎo)的 HIF-1α 是否調(diào)節(jié)CXCL12 表達(dá)，我們敲低了基質(zhì)細(xì)胞中的 HIF-1α，并用外泌體處理了細(xì)胞，以確認(rèn) HIF-1α 表達(dá)的喪失.

E 和F. 我們用 C4-2B PCa 衍生的外泌體處理基質(zhì)細(xì)胞，觀察到基質(zhì)細(xì)胞中 HIF-1α 的敲低顯著降低了外泌體介導(dǎo)的HIF-1α 誘導(dǎo)CXCL12 mRNA和蛋白質(zhì).