原發(fā)性前列腺癌通過外泌體丙酮酸激酶 M2 促進骨轉(zhuǎn)移

原發(fā)性前列腺癌通過外泌體丙酮酸激酶 M2 促進骨轉(zhuǎn)移

9月份，Jinlu Dai等人發(fā)表一篇“Primary prostate cancer educates bone stroma through exosomal pyruvate kinase M2 to promote bone metastasis.”的SCI文章，IF= 10.892，這項研究確定PCa 衍生的外泌體是否可以通過調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境來促進骨轉(zhuǎn)移，并確定實現(xiàn)該目的的機制。

骨轉(zhuǎn)移是許多轉(zhuǎn)移性癌癥的常見后遺癥。在患有晚期前列腺癌（PCa）的男性中，骨骼是最常見的轉(zhuǎn)移靶標。大約84％的男性會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移；而最常見的軟組織轉(zhuǎn)移部位，即肝臟在體重不太嚴重的男性中很少見治療后骨轉(zhuǎn)移，發(fā)生率低得多（?65％）.與軟組織轉(zhuǎn)移相比，促進 PCa 更頻繁地發(fā)展為臨床可檢測的骨轉(zhuǎn)移的機制尚未明確。轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，涉及成功建立臨床上有意義的轉(zhuǎn)移的多個步驟。廣義上講，增加的骨特異性可能是由于轉(zhuǎn)移性細胞相對于軟組織部位向骨骼的播種增加和/或骨骼微環(huán)境比軟組織部位更有效地促進 PCa 生長的能力。這些概念反映了Stephen Paget的“種子和土壤”理論，表明癌細胞與遠處微環(huán)境的某些組合可以優(yōu)化癌細胞的生長機會.但是，該理論并不要求在腫瘤生長之前就存在最佳的微環(huán)境。

因此，腫瘤可以利用來促進轉(zhuǎn)移的一種策略是改變遠處的微環(huán)境以促進腫瘤細胞的接種或腫瘤的生長。幾份報告表明，原發(fā)腫瘤釋放的外泌體可以修飾遠處，以促進這些部位的轉(zhuǎn)移.外泌體是在 30-120 nm 范圍內(nèi)的膜結(jié)合囊泡，在多囊泡體內(nèi)合成，并在多囊泡體與細胞膜融合后從細胞釋放.外泌體包含多種生物分子，包括蛋白質(zhì)， mRNA， lncRNA和 microRNA，它們可能會影響遠處的細胞功能。因此，來自原發(fā)腫瘤的外泌體可能能夠遞送改變遠處的生物分子，從而使其具有促進轉(zhuǎn)移的能力。此過程定義為“轉(zhuǎn)移前的niche”的創(chuàng)建。

技術(shù)路線：

一、前期準備工作

A.評估PCa外泌體是否影響影響轉(zhuǎn)移過程，從PCa細胞系中收獲外泌體，并對外泌體進行表征。從PC-3和C4-2B PCa細胞由基于電子顯微鏡代表性圖片。微囊泡的最大范圍為300 nm，并且大多數(shù)表達CD9，ALIX，和HSP70蛋白。

B.運用 NanoSight確定外泌體定大小分布。

C和D. 使用 Nanosight 測定每毫升來自C4-2B 或 PC3 條件下培養(yǎng)基和人類受試者的血清的外泌體數(shù)量。對外泌體蛋白質(zhì)marker進行蛋白質(zhì)印跡檢測。

一、PCa 衍生的外泌體促進小鼠骨骼中的腫瘤生長

A. 用外泌體對SCID小鼠進行預處理，隨后將PCa 細胞進行心內(nèi)（ic）注射（左心室），并連續(xù)處理外泌體 21 天。與媒介物相比，PCa 外泌體誘導了轉(zhuǎn)移部位數(shù)量的增加和總腫瘤負荷的增加。用 C4-2B 衍生的外泌體（A）或完全培養(yǎng)基的外泌體進行預處理 4 d，然后 ic 注射 PC3-熒光素酶細胞，連續(xù)外泌體治療 21 d。

B. 為了確定 PCa 患者的外泌體是否影響 PCa 轉(zhuǎn)移，我們使用健康男人血清與原發(fā)性 PCa 腫瘤患者的外泌體重復了 PCa小鼠模型實驗。與健康男性相比，患有原發(fā)性 PCa 腫瘤的男性的外泌體增加了轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移負擔的總數(shù)。

C. 我們用 PCa 外泌體預處理小鼠 4 d，將 PCa 細胞注入左心室，然后在 24 小時后收獲骨髓，以定量接種骨髓的 PCa 細胞。與媒介物處理相比，用 PCa 外泌體進行預處理可使骨髓中 PCa 細胞的播種量增加約 115％.

補充實驗結(jié)果：外源性外泌體對 PCa 的生長沒有影響。

D. 我們對細胞進行了工程改造以表達熒光標記的將工程改造為表達熒光外泌體的 PCa細胞注射到受體小鼠的前列腺中，并于 3 周后評估了骨髓基質(zhì)中的外泌體。注射腫瘤細胞后第 3 周，骨髓基質(zhì)中存在外泌體。我們最初將這些外泌體靜脈內(nèi)注射入小鼠體內(nèi)，并在 24小時內(nèi)鑒定出它們在骨髓基質(zhì)細胞（BMSC）中的存在。

E. 將工程改造為表達熒光外泌體的 PCa細胞注射到受體小鼠的前列腺中，并于 3 周后評估了骨髓基質(zhì)中的外泌體。注射腫瘤細胞后第 3 周，骨髓基質(zhì)中存在外泌體.

F.為了排除熒光是否是由于癌細胞在該時間點擴散所致，我們使用 PCR 對 Alu 序列進行了評估，評估了骨髓中人類細胞的存在.在任何骨髓樣本中均未發(fā)現(xiàn) Alu，這表明該時間點沒有人類細胞存在.

G. PCa 有轉(zhuǎn)移到骨骼的傾向。然而，它確實轉(zhuǎn)移到其他部位（例如肝臟），盡管頻率較低。為了確定 PCa 外泌體是否除了骨骼外還靶向軟組織部位，我們在小鼠中靜脈注射了熒光標記的 PCa 外泌體，并在 24 h 評估了腎臟，腦，肝，肺和骨髓的外泌體。外泌體存在于所有組織中。但是，在每個細胞的基礎上，它們靶向骨髓基質(zhì)的水平高于其他組織.

綜上所述，這些結(jié)果表明， PCa 外泌體對 PCa 細胞沒有直接影響，而是通過遙遠的靶微環(huán)境間接靶向和促進 PCa進程，并具有針對骨髓的選擇性。來自 PCa 細胞系條件培養(yǎng)基的外泌體，一旦在體內(nèi)注射后，可能會被修飾以直接對癌細胞產(chǎn)生影響，但這不太可能，因為 PCa 患者的外泌體包括體內(nèi)–衍生的外泌體對腫瘤細胞沒有直接影響，但是它們確實對體內(nèi)有影響。

二、PCa 衍生的外泌體教育骨基質(zhì)細胞增加 PCa 腫瘤細胞的增殖和侵襲

A. 評估了外泌體改變 BMSC 影響PCa 細胞生長的能力的程度。像以前一樣， PCa 外泌體對 PCa 細胞沒有直接作用。但是，未經(jīng)處理的基質(zhì)細胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基會抑制 PCa 細胞的生長。相反，用外泌體預處理的基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基（源自 PCa 細胞或 PCa 患者血清）可增加 PCa 細胞的生長

B. 將 PCa 細胞皮下植入了沒有基質(zhì)細胞或基質(zhì)細胞的膠原海綿中小鼠相反側(cè)面的細胞，然后用運載體或 PCa 外泌體處理小鼠。單獨的外泌體和單獨的基質(zhì)細胞都不會影響 PCa 的生長，而在充滿基質(zhì)細胞的海綿中，外泌體誘導 PCa 的生長

C. PCa 外泌體影響內(nèi)皮細胞，成骨細胞和破骨細胞前體細胞調(diào)節(jié) PCa 生長的能力。外泌體在成纖維細胞基質(zhì)細胞中作用最強，其次是成骨細胞，對內(nèi)皮細胞或破骨細胞沒有影響

D. 外泌體對 PCa 細胞侵襲特性的影響?；|(zhì)細胞條件培養(yǎng)基單獨促進 PCa 侵襲。然而，來自 PCa 細胞外泌體預處理的基質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基進一步提高了 PCa 細胞的侵襲能力。

三、PCa 衍生的外泌體增加基質(zhì)細胞中丙酮酸激酶 M2

A. 為了驗證外泌體調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞 PKM2 表達，將基質(zhì)細胞暴露于外泌體，并評估 PKM2 蛋白表達。PCa 外泌體增加了 ST2細胞和原代 BMSCs 中 PKM2 蛋白的表達。

B. PCa患者的外泌體增加了 ST2 細胞和原代 BMSCs 中 PKM2 蛋白的表達。

C. 與基質(zhì)細胞中 PKM2 蛋白的增加相反，基質(zhì)細胞中外泌體不會改變 PKM2 mRNA 的表達。

D. 我們發(fā)現(xiàn)用含有人 PKM2 的外來體處理基質(zhì)細胞會增加基質(zhì)細胞中人 PKM2 的表達.

E. 當基質(zhì)細胞用衍生自 PCa 細胞的外泌體處理時，人PKM2 沒有增加，其中 PKM2 被敲低。此外，當基質(zhì)細胞用衍生自 PCa 細胞的外泌體處理后，小鼠 PKM2并未增加，其中 PKM2 被敲除. 綜上所述，外泌體將 PKM2 蛋白轉(zhuǎn)移到基質(zhì)細胞，而不是誘導 PKM2 mRNA 合成或蛋白合成。

F. 表明外泌體將 PKM2 蛋白轉(zhuǎn)移到基質(zhì)細胞，而不是誘導 PKM2 mRNA 合成或蛋白合成

接下來，確定 PKM2 是否可以解釋外泌體調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞以促進 PCa 生長的能力。

A. PKM2 的敲低導致外泌體缺乏PKM2。補充實驗：PKM2 不會影響外泌體的產(chǎn)生。

B. 缺乏PKM2的外泌體不會改變ST2基質(zhì)細胞中PKM2蛋白的表達。

C. 將癌細胞系與基質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基一起培養(yǎng)，該基質(zhì)來自用缺乏 PKM2 的外泌體處理的基質(zhì)細胞。PCa 外泌體中 PKM2 表達增加導致喪失PCa 外泌體誘導 PCa 細胞生長的能力。

D. 敲除 PKM2 是否會影響原位原位腫瘤的生長。注射腫瘤細胞后第 14 天，安樂死每組小鼠的一部分，并測量腫瘤大小。在對照組和PKM2 基因敲低的 PCa 細胞之間，原位腫瘤的大小沒有差異。

E和F. 原發(fā)性原位腫瘤的存在（由對照加擾的 shRNA 細胞組成）增加了轉(zhuǎn)移的數(shù)量和總體轉(zhuǎn)移負擔。然而，在原發(fā)性腫瘤細胞中 PKM2 的敲低 部分減弱了原發(fā)性腫瘤增加轉(zhuǎn)移數(shù)目和轉(zhuǎn)移負擔的能力。這些結(jié)果證明原發(fā)性前列腺腫瘤促進轉(zhuǎn)移，而 PKM2 促進原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果與原發(fā)性腫瘤可以部分通過外泌體 PKM2 促進轉(zhuǎn)移的觀點相一致。

四、PCa 外泌體通過 PKM2 誘導的 BMSC 通過 CXCL12 促進PCa 腫瘤生長

目的：探討 PCa 外泌體中的 PKM2 是否調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞產(chǎn)生可溶因子以促進 PCa 生長

A. PKM2 敲低改變了幾種細胞因子的表達；然而，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4（BMP-4）和 CXCL12 的表達明顯降低。

B. PCa 衍生的外泌體誘導CXCL12 mRNA 和蛋白質(zhì)表達超過 13 倍，而敲除 PCa 外泌體中的 PKM2 降低了 PCa 衍生的外泌體誘導 CXCL12 mRNA和蛋白質(zhì)表達的能力。

C. PCa衍生的外泌體誘導 BMP-4 mRNA 的表達少于 1 倍，盡管PCa 衍生的外泌體中 PKM2 的敲低降低了 PCa 衍生的外泌體誘導 BMP-4 mRNA 表達的能力。

確定 PCa 外泌體培養(yǎng)的基質(zhì)細胞是否通過 CXCL12 促進 PCa 細胞生長

AMD3100：抑制CXCL12 結(jié)合其靶標

A和B. 來自 PCa 的外來體處理過的基質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基增加了 PC3 和 C4-2B 細胞的生長和侵襲。但是，AMD3100 取消了對增殖和入侵的誘導。

C和D. 來自 PCa 的外來體處理過的基質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基增加了 PC3 和 C4-2B 細胞的生長和侵襲。但是，AMD3100 取消了對增殖和入侵的誘導。

E. PCa 衍生的外泌體增加了 PCa 植入骨髓的能力，AMD3100 減少了 PC-3 細胞的接種。

F和G．PCa 衍生的外泌體增加了 C4-2B 和 PC-3 腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移數(shù)量和總轉(zhuǎn)移負擔，而 AMD3100 抑制了這些作用.

H. 為了進一步確認這些結(jié)果是通過 CXCL12： CXCR4信號軸介導的，我們敲低了 PC-3 細胞中 CXCR4 的表達.

I和J. PC-3 細胞中 CXCR4 的敲低減少了外來體誘導的接種以及轉(zhuǎn)移的數(shù)量和總轉(zhuǎn)移負擔.綜上所述，這些結(jié)果表明外泌體含有 PKM2，它可以刺激基質(zhì)細胞產(chǎn)生 CXCL12，從而促進 PCa 轉(zhuǎn)移的進展.

A-C. 確定外泌體是否促進了 HIF-1α 表達，并且這是否依賴于 PKM2。PC 衍生的外泌體刺激了 ST2 基質(zhì)細胞系和原代鼠 BMSCs 中的 HIF- 1αmRNA 和蛋白表達，而 PCa 衍生的外泌體中的 PKM2 敲低顯著降低了 HIF-1αmRNA 和蛋白表達的誘導.

D. PCa 衍生的外來體以 PKM2 依賴的方式促進 HIF-1α 表達。為了確定外泌體誘導的 HIF-1α 是否調(diào)節(jié)CXCL12 表達，我們敲低了基質(zhì)細胞中的 HIF-1α，并用外泌體處理了細胞，以確認 HIF-1α 表達的喪失.

E 和F. 我們用 C4-2B PCa 衍生的外泌體處理基質(zhì)細胞，觀察到基質(zhì)細胞中 HIF-1α 的敲低顯著降低了外泌體介導的HIF-1α 誘導CXCL12 mRNA和蛋白質(zhì).