巨噬細(xì)胞特異性HIF-1α導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎的自噬潮受損

 導(dǎo)語(yǔ):
 炎性細(xì)胞活化在肝病期間驅(qū)動(dòng)多種細(xì)胞程序設(shè)計(jì)。低氧誘導(dǎo)因子（HIFs）最近已被確定為免疫和炎癥的重要調(diào)節(jié)劑。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，HIF-1α在肝細(xì)胞中被上調(diào)，并誘導(dǎo)脂肪變性。然而，尚未探討HIF-1α在代謝應(yīng)激下巨噬細(xì)胞中的作用。
技術(shù)路線:
1、對(duì)比甲硫氨酸缺乏膽堿（MCD）飲食喂養(yǎng)的小鼠和NASH患者的巨噬細(xì)胞肝巨噬細(xì)胞中的HIF-1α的水平。
2、驗(yàn)證HIF-1α的增加與小鼠和人類巨噬細(xì)胞中自噬標(biāo)記物BNIP3，Beclin-1，LC3-II和p62之間的關(guān)聯(lián)。
3、證明在巨噬細(xì)胞中穩(wěn)定的HIF-1α水平的LysMCre-HIFdPAfl / fl小鼠與采用MCD飲食的HIFdPAfl / fl小鼠相比較脂肪變性和肝臟炎癥情況。
4、利用體外和離體實(shí)驗(yàn)表明飽和脂肪酸棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)HIF-1α并損害巨噬細(xì)胞的自噬通量。
5、使用siRNA介導(dǎo)的敲低和HIF-1α在巨噬細(xì)胞中的過度表達(dá)，證明PA通過HIF-1α損害自噬。
研究結(jié)果:
1、肝巨噬細(xì)胞增加了NASH中的HIF-1α表達(dá)并損害了自噬通量。
   使用了MCD飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型，以油-紅-O染色和明顯的壞死性炎癥指示的脂肪變性顯示。MCD飲食誘導(dǎo)的NASH的總肝臟HIF-1αmRNA水平顯著增加（5倍），并且分離的肝單核細(xì)胞（LMNCs升高6倍）。飼喂HF-HC-HS飲食的小鼠表現(xiàn)出與MCD飲食模型相似的肝臟和LMNC中HIF-1α升高的趨勢(shì)。檢測(cè)到MCD飲食喂養(yǎng)的小鼠中HIF-1α蛋白水平顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物，BNIP3，Beclin-1，LC3-II和p62的表達(dá)與MCS對(duì)照相伴增加。與MCS對(duì)照相比，MCD飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中F4 / 80染色證實(shí)了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的增加。與對(duì)照組相比，NASH肝巨噬細(xì)胞中HIF-1α和自噬標(biāo)志物Beclin-1，LC3-II，BNIP3和p62的含量均顯著更高（圖2B）。結(jié)果表明NASH中的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)涉及增加HIF-1α表達(dá)和減少自噬通量。

2、NASH患者的肝巨噬細(xì)胞和循環(huán)單核細(xì)胞顯示HIF-1α表達(dá)增加且自噬通量受損。
   在NASH患者的肝臟中，與健康對(duì)照組相比，我們檢測(cè)到F4 / 80 +巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，這與在MCD飲食喂養(yǎng)小鼠的肝臟中的發(fā)現(xiàn)一致。 接下來(lái)，比較了NASH患者和健康對(duì)照組的循環(huán)單核細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)和自噬標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)NASH患者的HIF-1α和LC3-II蛋白水平升高，但BNIP3，Beclin-1和p62水平?jīng)]有差異。 因此，結(jié)果表明NASH患者外周血單核細(xì)胞的自噬通量受損。

3、穩(wěn)定髓樣細(xì)胞中的HIF-1α可增強(qiáng)MCD飲食誘導(dǎo)的炎癥和脂肪變性。
   使用了LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠，其中髓樣細(xì)胞中HIF-1α的水平穩(wěn)定，導(dǎo)致HIF-1α的水平高于野生型小鼠。使用PCR證實(shí)了LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠和相應(yīng)的對(duì)照小鼠HIFdPAfl / fl的基因型。BMDM和肝巨噬細(xì)胞中HIF-1αmRNA水平增加，但肝細(xì)胞中HIF-1αmRNA水平?jīng)]有增加，這證實(shí)了HIF-1α的髓樣細(xì)胞特異性增加。在來(lái)自LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠的BMDM中，BNIP3和p62 mRNA水平以及LC3-II蛋白水平均升高。然而，p62蛋白水平并未顯著增加。與HIFdPAfl / fl小鼠相比，LysMCreHIFdPAfl / fl的肝巨噬細(xì)胞中MCP-1，IL-1β和IL-10的mRNA水平增加。與HIFdPAfl / fl小鼠相比，接受MCD飲食5周后，LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠表現(xiàn)出更大程度的肝脂肪變性和ALT水平。 MCP-1，TNF-α和PAI-1 mRNA水平的升高表明脂肪變性和肝損傷的增加以及肝臟炎癥的發(fā)生。總之，這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞HIF-1α水平的增加通過自噬通量的受損和促炎性細(xì)胞因子的增加而促進(jìn)了MCD飲食誘導(dǎo)的NASH。

4、棕櫚酸激活HIF-1α并削弱巨噬細(xì)胞自噬通量。
   PA治療原發(fā)性肝和骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）增加HIF-1αmRNA水平，然后上調(diào)HIF-1α靶基因BNIP3和PAI-1。BMDM中的HIF-1α蛋白水平也有所提高和PA處理后人類巨噬細(xì)胞與p62和LC3-II水平的升高相關(guān)。巴氟霉素與PA的組合不會(huì)進(jìn)一步增加LC3-II的水平。將LC3-II對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的條帶強(qiáng)度歸一化，并計(jì)算了經(jīng)bafilomycin處理與未處理的人類巨噬細(xì)胞的歸一化LC3-II條帶比率。人類THP-1巨噬細(xì)胞中的PA處理誘導(dǎo)HIF-1αmRNA水平迅速升高，并在3小時(shí)達(dá)到峰值，然后上調(diào)HIF-1α靶基因，BNIP3，PAI-1和Glut-1、12刺激后-24小時(shí)。HIF-1α蛋白水平和DNA結(jié)合PA處理后，人THP-1巨噬細(xì)胞中的活性也增加了。我們發(fā)現(xiàn)PA治療可導(dǎo)致BNIP3，Beclin-1，LC3-II和p62水平顯著增加巨噬細(xì)胞。使用熒光顯微鏡，證明了PA刺激后，具有LC3-II點(diǎn)狀細(xì)胞的百分比顯著增加，這是自噬的一種表現(xiàn)。bafilomycin加PA的組合并沒有進(jìn)一步增加LC3-II的水平。這表明自噬通量的減少以bafilomycin引起的LC3-II或p62誘導(dǎo)降低為代表。

5、HIF-1α調(diào)節(jié)PA刺激的巨噬細(xì)胞的自噬。
   為了測(cè)試HIF-1α是否在PA誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激下調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的自噬，檢查了其中siRNA敲低HIF-1α的巨噬細(xì)胞或通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了HIF-1α的巨噬細(xì)胞。使HIF-1α沉默可防止PA誘導(dǎo)的HIF-1α增加，并顯著下調(diào)BNIP3，Beclin-1和LC3-II表達(dá)。 HIF-1α的過表達(dá)顯著增加了PA誘導(dǎo)的HIF-1α和自噬成分BNIP3，Beclin-1和LC3-II的水平。PA刺激后，HIF-1α誘導(dǎo)在6-12小時(shí)達(dá)到峰值，BNIP3，Beclin-1和LC3-II在6-24小時(shí)左右達(dá)到峰值。在巴氟霉素處理的THP-1巨噬細(xì)胞中，PA在HIF-1α敲低細(xì)胞中增加了LC3-II的誘導(dǎo)，但在對(duì)照細(xì)胞中則沒有。 HIF-1α過表達(dá)產(chǎn)生相反的效果；與對(duì)照細(xì)胞相比，PA降低了過表達(dá)HIF-1α的經(jīng)巴菲霉素處理的巨噬細(xì)胞的LC3-II誘導(dǎo)。

6、HIF-1α介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)并下調(diào)NF-κB活化。
   PA處理后，THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB的DNA結(jié)合活性和促炎細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的水平呈時(shí)間依賴性增加。在HIF-1α敲低的細(xì)胞中，PA誘導(dǎo)的p65磷酸化被完全消除，在來(lái)自LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠的肝巨噬細(xì)胞中觀察到了類似的效果，顯示出增強(qiáng)的MCP-1和IL-1β。單獨(dú)使用3-MA抑制巨噬細(xì)胞的自噬會(huì)增加NF-κB的激活，而使用3-MA加PA的治療會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)這種激活。當(dāng)我們沉默負(fù)責(zé)自噬體形成的蛋白質(zhì)ATG5時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)未處理的細(xì)胞和用PA處理的細(xì)胞中LC3-II表達(dá)和p65磷酸化均降低。Bafilomycin治療未能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基或PA刺激的巨噬細(xì)胞中的p65磷酸化，表明自噬功能受損不會(huì)影響巨噬細(xì)胞中NF-κB的活化。用3-MA抑制自噬沒有明顯的附加作用。結(jié)果表明，HIF-1α參與了NF-κB的激活，巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)以及PA誘導(dǎo)的自噬的損害。

總結(jié)：
   棕櫚酸通過巨噬細(xì)胞中的HIF-1α激活來(lái)?yè)p害自噬。 HIF-1α和受損的自噬存在于NASH體內(nèi)的小鼠巨噬細(xì)胞和人血單核細(xì)胞中。從而發(fā)現(xiàn)，HIF-1α激活和自噬通量減少通過上調(diào)NF-κB激活刺激巨噬細(xì)胞中的炎癥。這些結(jié)果表明，NASH中的巨噬細(xì)胞活化涉及HIF-1α和自噬之間的復(fù)雜相互作用，因?yàn)檫@些途徑促進(jìn)MCD飲食誘導(dǎo)的NASH中的促炎性過度活化。
   這篇研究表明巨噬細(xì)胞特異性HIF-1α在NASH小鼠模型中的作用。盡管MCD飲食喂養(yǎng)的小鼠會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)蓄積，肝炎癥和纖維化，但它們并未表現(xiàn)出體重增加或胰島素抵抗，這在人類NASH患者中觀察到。但是，我們發(fā)現(xiàn)NASH患者的人類血液?jiǎn)魏思?xì)胞以及HF-HC-HS飲食的小鼠的肝臟和LMNC中的HIF-1α表達(dá)均增加，這可能暗示在HIF-1α表達(dá)增加后觀察到的效應(yīng)也可能存在于類人模型中。總之，在NASH中，PA對(duì)巨噬細(xì)胞中HIF-1α的激活在疾病進(jìn)展中具有重要作用。巨噬細(xì)胞中的HIF-1α激活降低自噬通量并增加IL-1β的產(chǎn)生。 HIF-1α還激活NF-κB，這對(duì)于MCP-1表達(dá)很重要。 IL-1β和MCP-1均可引起肝脂肪變性和炎癥。文章指出了巨噬細(xì)胞特異性HIF-1α在MCD飲食誘導(dǎo)的NASH中的重要作用。鑒于晚期NASH中普遍存在炎癥，因此未來(lái)的工作應(yīng)評(píng)估HIF-1α活化的巨噬細(xì)胞特異性靶向是否具有潛在的治療應(yīng)用。