Circ-AKT3—透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌治療的新靶標(biāo)

   環(huán)狀RNA（circRNA）是一種環(huán)狀內(nèi)源性RNA，通過(guò)特殊的選擇性剪接產(chǎn)生，參與多種疾病的進(jìn)展。然而，circRNA在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）中的作用仍鮮有報(bào)道。因此，小編和大家分享最近發(fā)表在Molecuar Cancer上的文章“Circ-AKT3 inhibits clear cell renal cell carcinoma metastasis via altering miR-296-3p/E-cadherin signals”，從而了解Circ-AKT3在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中的作用。

   我們使用環(huán)狀RNA芯片檢測(cè)ccRCC中circ-AKT3的低表達(dá)。然后，應(yīng)用qPCR芯片檢測(cè)60例ccRCC組織及鄰近正常組織中circ-AKT3的表達(dá)情況，以及在ccRCC細(xì)胞系和人正常腎細(xì)胞（HK-2）的表達(dá)情況。另外，我們?cè)隗w內(nèi)外研究了circ-AKT3在ccRCC中的作用，并通過(guò)Western blotting、生物信息學(xué)分析、RNA下拉實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)其作用機(jī)制。
結(jié)果：
1、Circ-AKT3在ccRCC中穩(wěn)定低表達(dá)
首先研究circRNA在ccRCC中的表達(dá)情況，我們使用circRNA芯片分析了3對(duì)與癌旁正常組織配對(duì)的ccRCC組織樣本（圖1a）。在ccRCC組織中總共有53個(gè)circRNA被顯著上調(diào)，30個(gè)circRNA被下調(diào)(圖1b)。然后，我們選擇了10個(gè)最顯著的高表達(dá)和低表達(dá)circRNA來(lái)驗(yàn)證它們?cè)赾cRCC組織樣本和細(xì)胞系中的豐度。與正常腎組織相比，ccRCC組織中AKT3基因位點(diǎn)明顯降低，這與circRNA芯片結(jié)果一致（圖1d-e）。此外，circ-AKT3在人類ccRCC細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)（圖1f）。通過(guò)RNase處理和qPCR檢測(cè)，結(jié)果表明circ-AKT3呈環(huán)狀，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)（圖1g）。

2、Circ-AKT3在ccRCC細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中起抑制作用
   為了探索circ-AKT3在ccRCC中的作用，我們使用了三種siRNA寡核苷酸來(lái)定位這個(gè)circRNA獨(dú)特的反向剪接連接。反義剪接連接的siRNAs可顯著降低circ-AKT3的表達(dá)，而線性AKT3 mRNA水平未見(jiàn)下降（圖2a）。利用Geneseed合成circ-AKT3過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，利用qRT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率（圖2b）。在敲低circ-AKT3后，OSRC-2細(xì)胞在傷口愈合實(shí)驗(yàn)中顯示出增強(qiáng)的遷移能力，反之亦然（圖2c）。Transwell試驗(yàn)進(jìn)一步證明了沉默circ-AKT3顯著促進(jìn)了OSRC-2細(xì)胞的遷移和侵襲（圖2d，e）。與此同時(shí)，過(guò)度的circ-AKT3顯著抑制SW839細(xì)胞的遷移和侵襲（圖2f，h）。綜上所述，circ-AKT3通過(guò)抑制ccRCC細(xì)胞的遷移和侵襲而起到保護(hù)作用。

3、Circ-AKT3通過(guò)恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)來(lái)抑制ccRCC的遷移和侵襲
   為了檢測(cè)circ-AKT3在ccRCC中的具體作用機(jī)制，我們將研究重點(diǎn)放在了ccRCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因上。其中，Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因E-cadherin明顯受circ-AKT3調(diào)控（圖3a）。之前有研究表明，E-cadherin在ccRCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵的保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，腫瘤組織中E-cadherin的mRNA水平較癌旁組織大多數(shù)下調(diào)（圖3b，c）。

4、miR-296-3p被circ-AKT3吸收，在ccRCC轉(zhuǎn)移中起積極作用
   由于circRNA的功能主要是作為miRNA的海綿調(diào)節(jié)下游基因，我們接下來(lái)探討了circ-AKT3與miRNA結(jié)合的能力。使用在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)尋找靶向E-cadherin mRNA的潛在miRNA，并作為circ-AKT3海綿，預(yù)測(cè)了4種miRNA（miR-330- 3p、miR-296-3p、miR-382-5p和miR-326）（圖3d）。結(jié)果表明，miR-296-3p、miR-382-5p和miR-326均被circ-AKT3海綿化（圖3e，f）。
   隨后，我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR- 296-3p、miR-382-5p和miR-326在配對(duì)的ccRCC組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR- 296-3p在配對(duì)和未配對(duì)的ccRCC組織中表達(dá)增加（圖4a）。然而，miR-382-5p在ccRCC組織中表達(dá)下降（圖4b），而miR-326在ccRCC組織與鄰近正常組織中無(wú)顯著差異（圖4c）。Transwell實(shí)驗(yàn)被用來(lái)確定miRNA在ccRCC轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果表明，只有miR-296-3p促進(jìn)了ccRCC細(xì)胞的遷移（圖4d-g），而其他兩個(gè)miRNA對(duì)ccRCC細(xì)胞的遷移沒(méi)有影響。因此，這些結(jié)果表明，miR-296-3p在ccRCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了積極作用，circ-AKT3充當(dāng)了miR-296-3p的海綿。

5、miR-296-3p介導(dǎo)circ-AKT3依賴性的E-cadherin表達(dá)和細(xì)胞遷移侵襲
   為了研究circ- AKT3與miR-296-3p在ccRCC細(xì)胞中的功能相互作用，我們使用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，miR-296-3p模擬物促進(jìn)了OSRC-2細(xì)胞的遷移和侵襲，可以通過(guò)添加circ- AKT3來(lái)挽救（圖5a，b）。此外，miR-296-3p模擬物顯著抑制了E-cadherin的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染circ-AKT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，這種作用可以逆轉(zhuǎn)（圖5c）。在SW839細(xì)胞中重復(fù)進(jìn)行Transwell分析和western blotting分析，結(jié)果與OSRC-2細(xì)胞一致（圖5d-f）。
   為了確定預(yù)測(cè)的circ-AKT3序列中miR-296-3p結(jié)合位點(diǎn)是否對(duì)其相互作用至關(guān)重要，我們將預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)中circ-AKT3的野生型和突變序列插入熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO中（圖5g）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染野生型序列的OSRC-2和SW839細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低，而轉(zhuǎn)染突變型序列的細(xì)胞與對(duì)照組相比沒(méi)有差異（圖5h）。這些數(shù)據(jù)表明，circ-AKT3可能通過(guò)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)作為miR-296-3p的海綿。接下來(lái)，為了確定miR-296-3p是否可以與E-cadherin mRNA 3’-UTR結(jié)合，我們構(gòu)建了含野生型Ecadherin 3'-UTR和具有潛在位點(diǎn)突變的3 '-UTR的報(bào)告質(zhì)粒（圖5i）。如圖5j所示，miR-296-3p模擬物可降低轉(zhuǎn)染含有野生型E-cadherin mRNA 3’-UTR序列質(zhì)粒的細(xì)胞的熒光素酶活性，而轉(zhuǎn)染miR-296-3p結(jié)合位點(diǎn)突變的組未見(jiàn)此效應(yīng)，表明miR-296-3p直接在預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)與E-cadherin mRNA的3’-UTR結(jié)合。綜上所述， circ-AKT3通過(guò)充當(dāng)miR-296-3p的海綿，在一定程度上抑制了E-cadherin mRNA的降解，從而抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲。

6、circ-AKT3的修復(fù)抑制了ccRCC的體內(nèi)轉(zhuǎn)移
   進(jìn)一步的體內(nèi)研究是為了確定circ-AKT3的強(qiáng)制表達(dá)對(duì)ccRCC轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用。將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞感染circ-AKT3過(guò)表達(dá)慢病毒，經(jīng)puromycin篩選后，將OSRC- 2-luciferase-circ-AKT3或OSRC-2-luciferase-vector細(xì)胞注射到BALB/c裸小鼠腎包膜下。與載體組相比，注射過(guò)表達(dá)circ-AKT3細(xì)胞的裸鼠轉(zhuǎn)移灶較少（圖6a-d）。此外，與對(duì)照組相比，OE-circ-AKT3組的E-cadherin表達(dá)水平明顯上調(diào)（圖6e）。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在OE-circ-AKT3腫瘤中，E-cadherin表達(dá)明顯增強(qiáng)。綜上所述，這些結(jié)果表明circ-AKT3的強(qiáng)制表達(dá)能夠有效抑制ccRCC在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。

結(jié)論:
   Circ-AKT3通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-296-3p來(lái)抑制E-cadherin的表達(dá)，從而抑制ccRCC的轉(zhuǎn)移。因此，Circ-AKT3可以作為一種新的治療手段，更好地抑制ccRCC的轉(zhuǎn)移。