Circ-AKT3—透明細胞腎細胞癌治療的新靶標

   環(huán)狀RNA（circRNA）是一種環(huán)狀內源性RNA，通過特殊的選擇性剪接產生，參與多種疾病的進展。然而，circRNA在透明細胞腎細胞癌（ccRCC）中的作用仍鮮有報道。因此，小編和大家分享最近發(fā)表在Molecuar Cancer上的文章“Circ-AKT3 inhibits clear cell renal cell carcinoma metastasis via altering miR-296-3p/E-cadherin signals”，從而了解Circ-AKT3在透明細胞腎細胞癌轉移中的作用。

   我們使用環(huán)狀RNA芯片檢測ccRCC中circ-AKT3的低表達。然后，應用qPCR芯片檢測60例ccRCC組織及鄰近正常組織中circ-AKT3的表達情況，以及在ccRCC細胞系和人正常腎細胞（HK-2）的表達情況。另外，我們在體內外研究了circ-AKT3在ccRCC中的作用，并通過Western blotting、生物信息學分析、RNA下拉實驗和熒光素酶報告基因實驗檢測其作用機制。
結果：
1、Circ-AKT3在ccRCC中穩(wěn)定低表達
首先研究circRNA在ccRCC中的表達情況，我們使用circRNA芯片分析了3對與癌旁正常組織配對的ccRCC組織樣本（圖1a）。在ccRCC組織中總共有53個circRNA被顯著上調，30個circRNA被下調(圖1b)。然后，我們選擇了10個最顯著的高表達和低表達circRNA來驗證它們在ccRCC組織樣本和細胞系中的豐度。與正常腎組織相比，ccRCC組織中AKT3基因位點明顯降低，這與circRNA芯片結果一致（圖1d-e）。此外，circ-AKT3在人類ccRCC細胞系中表達下調（圖1f）。通過RNase處理和qPCR檢測，結果表明circ-AKT3呈環(huán)狀，在細胞內穩(wěn)定表達（圖1g）。

2、Circ-AKT3在ccRCC細胞的遷移和侵襲過程中起抑制作用
   為了探索circ-AKT3在ccRCC中的作用，我們使用了三種siRNA寡核苷酸來定位這個circRNA獨特的反向剪接連接。反義剪接連接的siRNAs可顯著降低circ-AKT3的表達，而線性AKT3 mRNA水平未見下降（圖2a）。利用Geneseed合成circ-AKT3過表達慢病毒質粒，利用qRT-PCR檢測其轉染效率（圖2b）。在敲低circ-AKT3后，OSRC-2細胞在傷口愈合實驗中顯示出增強的遷移能力，反之亦然（圖2c）。Transwell試驗進一步證明了沉默circ-AKT3顯著促進了OSRC-2細胞的遷移和侵襲（圖2d，e）。與此同時，過度的circ-AKT3顯著抑制SW839細胞的遷移和侵襲（圖2f，h）。綜上所述，circ-AKT3通過抑制ccRCC細胞的遷移和侵襲而起到保護作用。

3、Circ-AKT3通過恢復E-cadherin的表達來抑制ccRCC的遷移和侵襲
   為了檢測circ-AKT3在ccRCC中的具體作用機制，我們將研究重點放在了ccRCC轉移相關的基因上。其中，Western blot結果顯示，與轉移相關的基因E-cadherin明顯受circ-AKT3調控（圖3a）。之前有研究表明，E-cadherin在ccRCC轉移中發(fā)揮關鍵的保護作用。通過對TCGA數據庫的分析，腫瘤組織中E-cadherin的mRNA水平較癌旁組織大多數下調（圖3b，c）。

4、miR-296-3p被circ-AKT3吸收，在ccRCC轉移中起積極作用
   由于circRNA的功能主要是作為miRNA的海綿調節(jié)下游基因，我們接下來探討了circ-AKT3與miRNA結合的能力。使用在線生物信息學數據庫尋找靶向E-cadherin mRNA的潛在miRNA，并作為circ-AKT3海綿，預測了4種miRNA（miR-330- 3p、miR-296-3p、miR-382-5p和miR-326）（圖3d）。結果表明，miR-296-3p、miR-382-5p和miR-326均被circ-AKT3海綿化（圖3e，f）。
   隨后，我們基于TCGA數據庫分析miR- 296-3p、miR-382-5p和miR-326在配對的ccRCC組織中的表達水平。結果顯示，miR- 296-3p在配對和未配對的ccRCC組織中表達增加（圖4a）。然而，miR-382-5p在ccRCC組織中表達下降（圖4b），而miR-326在ccRCC組織與鄰近正常組織中無顯著差異（圖4c）。Transwell實驗被用來確定miRNA在ccRCC轉移中的作用。結果表明，只有miR-296-3p促進了ccRCC細胞的遷移（圖4d-g），而其他兩個miRNA對ccRCC細胞的遷移沒有影響。因此，這些結果表明，miR-296-3p在ccRCC細胞的轉移中發(fā)揮了積極作用，circ-AKT3充當了miR-296-3p的海綿。

5、miR-296-3p介導circ-AKT3依賴性的E-cadherin表達和細胞遷移侵襲
   為了研究circ- AKT3與miR-296-3p在ccRCC細胞中的功能相互作用，我們使用Transwell實驗進行了挽救實驗。我們發(fā)現，miR-296-3p模擬物促進了OSRC-2細胞的遷移和侵襲，可以通過添加circ- AKT3來挽救（圖5a，b）。此外，miR-296-3p模擬物顯著抑制了E-cadherin的表達，而轉染circ-AKT3過表達質粒后，這種作用可以逆轉（圖5c）。在SW839細胞中重復進行Transwell分析和western blotting分析，結果與OSRC-2細胞一致（圖5d-f）。
   為了確定預測的circ-AKT3序列中miR-296-3p結合位點是否對其相互作用至關重要，我們將預測結合位點中circ-AKT3的野生型和突變序列插入熒光素酶報告載體pmirGLO中（圖5g）。結果表明，轉染野生型序列的OSRC-2和SW839細胞的熒光素酶活性顯著降低，而轉染突變型序列的細胞與對照組相比沒有差異（圖5h）。這些數據表明，circ-AKT3可能通過預測的結合位點作為miR-296-3p的海綿。接下來，為了確定miR-296-3p是否可以與E-cadherin mRNA 3’-UTR結合，我們構建了含野生型Ecadherin 3'-UTR和具有潛在位點突變的3 '-UTR的報告質粒（圖5i）。如圖5j所示，miR-296-3p模擬物可降低轉染含有野生型E-cadherin mRNA 3’-UTR序列質粒的細胞的熒光素酶活性，而轉染miR-296-3p結合位點突變的組未見此效應，表明miR-296-3p直接在預測的結合位點與E-cadherin mRNA的3’-UTR結合。綜上所述， circ-AKT3通過充當miR-296-3p的海綿，在一定程度上抑制了E-cadherin mRNA的降解，從而抑制了細胞的遷移和侵襲。

6、circ-AKT3的修復抑制了ccRCC的體內轉移
   進一步的體內研究是為了確定circ-AKT3的強制表達對ccRCC轉移的調節(jié)作用。將穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞感染circ-AKT3過表達慢病毒，經puromycin篩選后，將OSRC- 2-luciferase-circ-AKT3或OSRC-2-luciferase-vector細胞注射到BALB/c裸小鼠腎包膜下。與載體組相比，注射過表達circ-AKT3細胞的裸鼠轉移灶較少（圖6a-d）。此外，與對照組相比，OE-circ-AKT3組的E-cadherin表達水平明顯上調（圖6e）。免疫組化結果顯示，與對照組相比，在OE-circ-AKT3腫瘤中，E-cadherin表達明顯增強。綜上所述，這些結果表明circ-AKT3的強制表達能夠有效抑制ccRCC在體內的轉移。

結論:
   Circ-AKT3通過競爭性結合miR-296-3p來抑制E-cadherin的表達，從而抑制ccRCC的轉移。因此，Circ-AKT3可以作為一種新的治療手段，更好地抑制ccRCC的轉移。