抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展——m6A是關(guān)鍵

   直腸癌是指從齒狀線至直腸乙狀結(jié)腸交界處之間的癌，是消化道最常見的惡性腫瘤之一。直腸癌位置低，容易被直腸指診及乙狀結(jié)腸鏡診斷。但因其位置深入盆腔，解剖關(guān)系復(fù)雜，手術(shù)不易徹底，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。YAP活化是結(jié)直腸癌(CRC)等腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。然而，目前尚不清楚N6-Methyl腺苷(m6A)是否修飾了lon的轉(zhuǎn)錄本。 G非編碼RNA(LncRNAs)可調(diào)節(jié)YAP在腫瘤進(jìn)展過程中的活化。2019年10月16日發(fā)表于 Mol. Cancer的一篇文章‘Long noncoding RNA GAS5 inhibits progression of colorectal cancer by interacting with and triggering YAP phosphorylation and degradation and is negatively regulated by the m6A reader YTHDF3’（影響因子： 10.679），主要研究了LncRNAs與m6A修飾在YAP信號傳遞和CRC進(jìn)展中的功能聯(lián)系。
結(jié)果:
一、與YAP相互作用的lncRNA的篩選和鑒定
   在八種不同的CRC細(xì)胞系中分析GAS5表達(dá)與CRC細(xì)胞中的YAP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)GAS5被抑制時，核YAP蛋白會積累，而當(dāng)GAS5過表達(dá)時，核YAP蛋白會下降。與YAP相互作用的lncRNA的候選物數(shù)量，并發(fā)現(xiàn)GAS5與YAP直接相互作用并抑制YAP的核積累。

二、GAS5與YAP蛋白相互作用的生化特征
   GAS5突變體Δ3與YAP結(jié)合的效率與全長GAS5一樣有效，而其他突變體完全失去了其結(jié)合能力，表明與YAP結(jié)合需要GAS5的262-480位核苷酸。GAS5與YAP的171-263個氨基酸（aa）區(qū)結(jié)合（圖2j）該區(qū)域編碼稱為WW域的結(jié)構(gòu)域，圖2k顯示了YAP GAS5結(jié)合復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。利用兩種獨(dú)立的方法，包括生物層干涉法（BLI）分析，RNA熒光原位雜交（RNA FISH）和免疫熒光共染色測定法，以鑒定lncRNA GAS5與YAP之間的相互作用。進(jìn)行了BLI分析，以檢驗(yàn)YAP–GAS5復(fù)合物與Fortebio Octet系統(tǒng)的結(jié)合親和力。生化映射表明，GAS5直接與YAP的WW域相互作用，以促進(jìn)內(nèi)源性YAP從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。                                                                            

三、GAS5促進(jìn)YAP磷酸化，以促進(jìn)其泛素化和降解
   GAS5-/-降低了絲氨酸127處的YAP磷酸化水平，上調(diào)了YAP目標(biāo)基因CTGF的表達(dá)。由于GAS5的上調(diào)顯著抑制了YAP的總蛋白水平，而使YAP的mRNA水平保持不變，GAS5過表達(dá)細(xì)胞中多泛素化的YAP蛋白顯著增加。與全長GAS5一樣，GAS5突變體-Δ3的過度表達(dá)成功地促進(jìn)了YAP磷酸化，而其他突變體則完全喪失了促進(jìn)YAP磷酸化的能力（圖3f）。在YAP抑制和GAS5上調(diào)組中，針對差異表達(dá)基因的KEGG通路分析的相交分析表明，共有543個共同目標(biāo)高度重疊，主要在同一方向和豐富了Hippo途徑，強(qiáng)烈支持GAS5在YAP信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵作用（圖3h-i）。GAS5通過促進(jìn)YAP磷酸化和胞質(zhì)螯合以促進(jìn)其泛素化和降解來抑制YAP信號傳導(dǎo)。

四、LncRNA GAS5通過體內(nèi)外YAP失調(diào)抑制大腸癌進(jìn)展
   為了研究GAS5在CRC進(jìn)展中的作用在體外和體內(nèi)，進(jìn)行構(gòu)建穩(wěn)定地過表達(dá)GAS5或與YAP共轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞系。GAS5的過表達(dá)顯著抑制了CRC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而增加的YAP表達(dá)成功逆轉(zhuǎn)了GAS5介導(dǎo)的對CRC細(xì)胞增殖的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示GAS5的過度表達(dá)顯著損害了腫瘤的生長，同時伴隨著細(xì)胞活力和腫瘤體積的下降。說明GAS5通過在體外和體內(nèi)抑制YAP信號傳導(dǎo)來抑制CRC進(jìn)展。

五、YTHDF3是YAP的新型靶標(biāo)，可在體外和體內(nèi)受GAS5調(diào)控
   由于YAP的失調(diào)對CRC的病理生物學(xué)和進(jìn)展具有重要意義，因此進(jìn)行RNA干擾介導(dǎo)的YAP敲除，以發(fā)現(xiàn)CRC腫瘤進(jìn)展的潛在新靶標(biāo)。 YAP的過表達(dá)增加了YTHDF3的表達(dá)以及CTGF和CYR61的表達(dá)。 CRC細(xì)胞中，YAP和YTHDF3之間的mRNA和蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（圖5g，h），YTHDF3是一個新穎的靶標(biāo)YAP。YAP與YTHDF3的啟動子結(jié)合，YAP共轉(zhuǎn)染到CRC細(xì)胞中，YTHDF3啟動子的熒光素酶活性大大增強(qiáng)，而YAP特異性siRNA顯著抑制了熒光素酶活性（圖5j）。

   功能獲得和功能喪失分析表明，YTHDF3的敲低取消了YAP介導(dǎo)的CRC細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用， GAS5的過表達(dá)抑制了YTHDF3和CTGF的表達(dá)，而YTHDF3的上調(diào)逆轉(zhuǎn)了GAS5介導(dǎo)的YTHDF3和CTGF的抑制作用。功能測定表明，GAS5的上調(diào)顯著抑制了CRC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而YTHDF3的共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了GAS5介導(dǎo)的CRC細(xì)胞增殖的抑制作用。腫瘤皮下生長和肺轉(zhuǎn)移異種移植小鼠模型表明，YTHDF3的過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤生長速率和肺部定植能力的顯著加速，從而逆轉(zhuǎn)了由GAS5過表達(dá)導(dǎo)致的腫瘤抑制（圖6f和h）。表明YTHDF3是YAP的新靶標(biāo)，而GAS5通過抑制YAPDF介導(dǎo)的YTHDF3在體內(nèi)和體外的表達(dá)來抑制CRC細(xì)胞的增殖和侵襲。

六、YTHDF3結(jié)合m6A修飾的GAS5并促進(jìn)GAS5的衰變
   由于在GAS5中積累了m6A修飾，YTHDF3敲低導(dǎo)致GAS5表達(dá)顯著增加，表明YTHDF3在m6A介導(dǎo)的GAS5降解中起主要作用。YTHDF3選擇性結(jié)合m6A修飾的GAS5并以甲基化依賴性方式調(diào)節(jié)GAS5降解，為CRC進(jìn)展中GAS5失調(diào)提供了基礎(chǔ)。

七、CRC患者腫瘤中LncRNA GAS5表達(dá)與YAP和YTHDF3蛋白水平呈負(fù)相關(guān)
   與鄰近組織相比，CRC組織中GAS5的表達(dá)降低，而GAS5較低的表達(dá)與CRC患者腫瘤組織中YAP和YTHDF3的表達(dá)升高有關(guān)。后發(fā)現(xiàn)YTHDF3的高表達(dá)是CRC患者總體生存不良的重要預(yù)后因素，為CRC治療提供了一種有希望的方法。

結(jié)論:
   lncRNAs和CRC中YAP信號的m6A修飾之間的功能聯(lián)系。LncRNA GAS5直接與YAP結(jié)合，促進(jìn)其磷酸化和泛素介導(dǎo)的降解，從而減弱YTHDF3的YAP介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，后者可逆、選擇性地與m6A甲基化的GAS5結(jié)合，觸發(fā)其衰變，形成負(fù)反饋環(huán)。該實(shí)驗(yàn)提出了lncRNA GAS5-YAP-YTHDF3軸在CRC進(jìn)展中的負(fù)功能環(huán)，這可能為CRC的治療提供一種有前景的方法。