新發(fā)現(xiàn)-YTHDF2可促進肝細胞癌的炎癥和血管異常

   YTHDF2（YTH域家族2）是最有效的m 6通過識別和分發(fā)米削弱mRNA穩(wěn)定性的讀取器6含有A-mRNA的一種處理機構(gòu)。最近的報告稱為YTHDF2是能夠降解兩種腫瘤啟動子和抑制基因的mRNA。雖然它增強了白血病干細胞的自我更新，但內(nèi)源性YTHDF2在實體癌中的基本作用仍存在疑問。
   盡管在許多人類癌細胞系中發(fā)現(xiàn)了成千上萬個m6A位點，但對于癌癥進展過程中的表觀基因組改變以及任何特定類型的癌癥患者中的轉(zhuǎn)錄組特征，人們所知甚少。癌細胞的代謝特征對于適應(yīng)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的變化至關(guān)重要，通常有助于表觀遺傳可塑性。作為最公認的癌標志之一，缺氧可通過降低的酶活性，調(diào)節(jié)基因表達或增加代謝物產(chǎn)生[影響DNA甲基化和組蛋白甲基化或乙?；?。以m6A-mRNA編輯，缺氧誘導因子（HIF）上調(diào)ALKBH5表達，從而導致乳腺癌細胞中NANOG mRNA脫甲基。盡管如此，oncometabolite 2-羥基（2HG）衰減FTO活性，從而增加全球米6在2HG敏感白血病或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中。另一項研究報道，缺氧廣泛地增加了對mRNA的m6A修飾，導致獲得了更高的mRNA穩(wěn)定性，而不是m6A介導的衰變。這些發(fā)現(xiàn)都表明腫瘤缺氧導致了m6A表觀遺傳重塑，但尚未確定普遍的改變和觸發(fā)這些改變的分子。
   今年11月份，Jiajie Hou等人在Mol Cancer發(fā)表一篇 “YTHDF2 reduction fuels inflammation and vascular abnormalization in hepatocellular carcinoma”的SCI文章。這篇文獻確定了人類肝癌標本和缺氧細胞系中m6A修飾的特征增益與mRNA表達的增加有關(guān)。在整個轉(zhuǎn)錄組中，這些“過度上調(diào)”的基因與癌癥進展的分子重排顯著相關(guān)。預(yù)測HCC（肝癌）患者分類和預(yù)后不良的YTHDF2的減少與這種轉(zhuǎn)錄編排高度相關(guān)，并促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。進一步揭示由THDF2的轉(zhuǎn)錄抑制HIF-2α，在腎細胞癌和肝癌已被應(yīng)用于靶向治療。 HIF-2α拮抗劑（PT2385）的給藥得以恢復(fù)，并需要YTHDF2來抑制炎癥相關(guān)的癌癥進展?？傊?，該文獻強調(diào)了YTHDF2在HCC中具有阻斷低氧誘導的表觀遺傳-炎癥-癌癥軸的保護作用。
技術(shù)路線：

一、人類HCC在m 6 A-mRNA景觀中表現(xiàn)出“高變”變化

人類HCC中m6A-mRNA的過度上調(diào)和YTHDF2的下調(diào)。（a）使用LC-MS/MS評估，成對的腫瘤和癌旁mRNA中的m6A水平。n=37例患者。（b）通過MeRIP-Seq測定，與副腫瘤相比，腫瘤中m6A-mRNA改變的百分比（分類為低表達，低表達，高表達和高表達）。n=8位患者。（c）通過RNA-seq確定的配對腫瘤與副腫瘤mRNA中的缺氧簽名基因表達的基因集富集分析。n=8位患者。NES，標準化富集得分。（d）米6使用LC-MS/MS評估，在缺氧條件下生長0、6、12或24h的人類HCC細胞系的mRNA表達水平。n=2個獨立實驗。（e）使用MeRIP-Seq檢測到，缺氧（Hx）與正常氧（Nx）24小時后，SMMC7721細胞m6A峰的變化。在P<0.05和5％FDR調(diào)整下，突出顯示（紫色）或丟失（淺藍色）m6A的峰。（f）在低氧或常氧條件下，不同轉(zhuǎn)錄片段中m6A峰的分數(shù)。（g）高甲基化峰中mRNA的表達變化。（h）YTHDF2在配對的腫瘤（T）和副腫瘤（P）組織中的免疫印跡。?=7位患者。（i）通過RT-qPCR評估的成對的腫瘤和癌旁組織中的YTHDF2mRNA水平。n=51位患者。（j）散點圖，顯示m6A水平與YTHDF2表達之間的相關(guān)性。顯示了線性最佳擬合線，皮爾遜相關(guān)系數(shù)（r）和P值（P）。n=37例患者。（k）Kaplan-Meier分析YTHDF2表達水平與HCC患者的總生存（左）或無復(fù)發(fā)生存（右）之間的相關(guān)性。n=總共200名患者。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過兩個尾部t檢驗確定P值

二、YTHDF2與HCC轉(zhuǎn)錄組和臨床結(jié)果相關(guān)

（a）通過CCK8評估5d生長的SMCMC7721-shCtrl和SMMC7721-shYTHDF2細胞的增殖活性（左），或通過正常氧（Nx）或缺氧（Hx）的另外24h的生長并通過WST1分析評估的增殖活性（右）。n=4–6個生物學重復(fù)。（b）在Nx或Hx下，將HUVEC與所示SMMC7721細胞共培養(yǎng)24h形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個生物學重復(fù)。（c，d）將指示的SMMC7721（c）或MHCC97H（d）細胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指定的日期測量腫瘤體積。?=5–6只老鼠。（e）肺組織的H＆E染色，顯示轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)起源于MHCC97H細胞。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（f）SMCD7721衍生腫瘤中的微血管密度（MVD），通過CD31染色和微血管區(qū)域定量評估。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（克）血管擬態(tài)在MHCC97H衍生的腫瘤，如通過PAS的數(shù)字量化+CD31-腫瘤細胞內(nèi)襯通道。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（h-j）肉眼觀察（h），腫瘤數(shù)目（i）和8.5個月大的注射DEN和CCL4的Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肝臟的最大腫瘤大小。n=7–9只小鼠。（j）Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肺中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的H＆E染色。n=7–9只小鼠。比例尺，50μm。（k）CD31和NG2的免疫熒光染色，顯示Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肝臟中的微血管和周細胞覆蓋。n=7–9只小鼠。比例尺，50μm。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過兩個尾部t檢驗確定P值。

三、YTHDF2缺乏癥加劇了炎癥和血管異常

（a）火山圖，顯示了SMMC7721-shYTHDF2與SMMC7721-shCtrl細胞中（紅色）或（藍色）下調(diào)的基因，通過RNA序列評估。（b）基于（A）中的RNA-seq的GO分析，顯示了最重要的GO項和P值。（c）篩選策略顯示出一組重疊基因，它們在YTHDF2缺陷誘導的上調(diào)和缺氧誘導的上調(diào)同時發(fā)生。（d，g）顯示在STAT3磷酸化（d）和SerpinE2（g）表達的指示的SMMC7721細胞在Nx或Hx下生長24小時的免疫印跡。?=2個獨立實驗。（e）在Nx或Hx下生長24h的SMMC7721細胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相對mRNA水平的RT-qPCR分析。n=3個生物學重復(fù)。（f）在Nx或Hx下生長24小時的所指示SMMC7721細胞的培養(yǎng)上清液中IL-11的定量蛋白質(zhì)水平的ELISA分析。n=3個生物學重復(fù)。（h）如通過RNA-seq評估的，在低氧下生長12小時的SMMC7721-OE細胞與SMMC7721-EV細胞中顯示出上調(diào)（紅色）或下調(diào)（藍色）的基因的火山圖。（我RT-qPCR分析在Hx下生長0、6、12或24h的SMMC7721-EV和SMMC7721-OE細胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相對mRNA水平。n=3個生物學重復(fù)。（j）顯示在指定的SMMC7721細胞中在Nx或Hx下生長24小時的STAT3磷酸化的免疫印跡。n=2個獨立實驗。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過兩個尾部t檢驗確定P值。

四、YTHDF2降解m 6含IL11和SERPINE2 mRNA

（a）通過MeRIP-qPCR評估，SMMC7721細胞中表達空載體（EV）或過表達YTHDF2（OE）的IL11和SERPINE2mRNA中的m6A富集。使細胞經(jīng)受Nx或Hx12小時。n=3個生物學重復(fù)。（b）通過RIP-qPCR測定，從SMMC7721-OE細胞免疫沉淀的YTHDF2-mRNA復(fù)合物中IL11和SERPINE2的基因富集。使細胞經(jīng)受Nx或Hx12小時。n=3個生物學重復(fù)。（c，d）通過監(jiān)測轉(zhuǎn)錄抑制（TI）后的轉(zhuǎn)錄物豐度確定，在指定的SMMC7721細胞中IL11和SERPINE2的RNA壽命。在TI引發(fā)之前，將細胞進行Nx或Hx處理8小時。n=3個生物學重復(fù)。（e）平均讀取密度，顯示使用MeRIP-seq評估的人HCC組織中IL11和SERPINE2轉(zhuǎn)錄物中鑒定出的m6A峰。n=8位患者。（f）熒光素酶報告基因測定，顯示在IL11（左）或SERPINE2（右）3'UTR存在下，YTHDF2對轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。指示的SMMC7721細胞在Nx或Hx下生長12小時。雷尼利亞將螢光素酶活性標準化為螢火蟲活性，并表示為相對螢光素酶活性。n=3個生物學重復(fù)。（g）YTHDF2和DCP1a（P體標記）在Nx或Hx下生長12h的SMMC7721細胞的免疫熒光染色。n=3個生物學重復(fù)。比例尺，5μm。（h）在Nx或Hx下生長12小時的所示SMMC7721細胞中IL11或SERPINE2mRNA的熒光原位雜交和DCP1a的免疫熒光染色。n=3個生物學重復(fù)。比例尺，5μm。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過兩個尾部t檢驗確定P值

（a）將空載體（EV）或編碼野生型（WT）或突變型YTHDF2的載體（W432A和W486A）轉(zhuǎn)導到具有YTHDF2-敲低（KD）背景的SMMC7721細胞中。通過CCK8（左）或WST1分析（右）評估了指示的SMMC7721細胞的增殖活性。n=5個生物學重復(fù)。（b）通過HUVEC與指定的SMMC7721細胞在Nx或Hx下共培養(yǎng)24小時共培養(yǎng)形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個生物學重復(fù)。（c）在Nx或Hx下生長24小時的SMMC7721細胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相對mRNA水平的RT-qPCR分析。n=3個生物學重復(fù)。（d）在Nx或Hx下生長24小時的指示SMMC7721細胞中培養(yǎng)上清液中IL-11定量蛋白質(zhì)水平的ELISA分析。n=3個生物學重復(fù)。（e）顯示在指定的SMMC7721細胞中在Nx或Hx下生長24小時的STAT3磷酸化和SerpinE2表達的免疫印跡。n=2個獨立實驗。（f）將指示的SMMC7721細胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指定的日期測量腫瘤體積。n＝5只小鼠。（克）將靶向IL11和SERPINE2的對照shRNA或shRNA導入YTHDF2-nockdown（KD）背景的SMMC7721細胞。通過CCK8（上）或WST1分析（下）評估指定的SMMC7721細胞的增殖活性。n=5個生物學重復(fù)。（h）由HUVEC與所示SMMC7721細胞共培養(yǎng)形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個生物學重復(fù)。（i）將指示的SMMC7721細胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指示的時間點測量腫瘤體積。n＝5只小鼠。（j）人肝癌組織陣列中IL-11和SerpinE2的免疫組織學染色，分為YTHDF2低和YTHDF2高根據(jù)YTHDF2的中值綜合光密度（IOD）值進行分類。n=143位患者。比例尺，200μm。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過兩個尾部t檢驗確定P值

五、缺氧以HIF-2α依賴性方式中斷YTHDF2表達

（a）YTHDF2和pimonidazole（PIMO）在SMMC7721衍生的小鼠腫瘤中的免疫熒光染色。缺氧腫瘤區(qū)域通過PIMO染色進行標記。n=3個生物學重復(fù)。比例尺，20μm。（b）YTHDF2在用對照siRNA（siCtrl）或靶向HIF-1/2α的siRNA轉(zhuǎn)導的SMMC7721細胞中的免疫印跡，并在Nx或Hx下生長24小時。n=2個獨立實驗。（c）在Nx或Hx暴露24小時后，表達指定siRNA的SMMC7721細胞中YTHDF2的RT-qPCR分析。（d）富集人缺氧反應(yīng)因子（HREs）的人類Ythdf2片段通過ChIP-qPCR確定DNA-HIF-2α復(fù)合物中的啟動子。n=4個生物學重復(fù)。（e）如使用熒光素酶測定法定量的，在表達指示的siRNA的SMMC7721細胞中Ythdf2啟動子活性。將海腎熒光素酶活性標準化為螢火蟲活性，并表示為相對熒光素酶活性。n=3個生物學重復(fù)。（f）如通過WST1測定所評估的，用媒介物或PT2385（10μM）處理的所指示的SMMC7721細胞的增殖活性。n=3個生物學重復(fù)。（g）在指定條件下共培養(yǎng)HUVEC形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個生物學重復(fù)。（h，j）YTHDF2（h）和p-STAT3（j）在用載體或PT2385（10μM）處理的SMMC7721細胞中的免疫印跡。n=2個獨立實驗。（i）RT11q分析IL11（左）和SERPINE2（右）mRNA水平。n=3個生物學重復(fù)。（k，l）具有SMMC7721-shCtrl（K）或SMMC7721-shYTHDF2（L）細胞的NPG小鼠在達到200mm3的平均腫瘤體積后用Vehicle或PT2385（20mg/kg/d）口服處理。在指定的治療日期連續(xù)測量腫瘤體積。n＝6只小鼠。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過兩個尾部t檢驗確定P值