新發(fā)現(xiàn)-YTHDF2可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的炎癥和血管異常

   YTHDF2（YTH域家族2）是最有效的m 6通過(guò)識(shí)別和分發(fā)米削弱mRNA穩(wěn)定性的讀取器6含有A-mRNA的一種處理機(jī)構(gòu)。最近的報(bào)告稱為YTHDF2是能夠降解兩種腫瘤啟動(dòng)子和抑制基因的mRNA。雖然它增強(qiáng)了白血病干細(xì)胞的自我更新，但內(nèi)源性YTHDF2在實(shí)體癌中的基本作用仍存在疑問(wèn)。
   盡管在許多人類癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了成千上萬(wàn)個(gè)m6A位點(diǎn)，但對(duì)于癌癥進(jìn)展過(guò)程中的表觀基因組改變以及任何特定類型的癌癥患者中的轉(zhuǎn)錄組特征，人們所知甚少。癌細(xì)胞的代謝特征對(duì)于適應(yīng)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的變化至關(guān)重要，通常有助于表觀遺傳可塑性。作為最公認(rèn)的癌標(biāo)志之一，缺氧可通過(guò)降低的酶活性，調(diào)節(jié)基因表達(dá)或增加代謝物產(chǎn)生[影響DNA甲基化和組蛋白甲基化或乙酰化。以m6A-mRNA編輯，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）上調(diào)ALKBH5表達(dá)，從而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中NANOG mRNA脫甲基。盡管如此，oncometabolite 2-羥基（2HG）衰減FTO活性，從而增加全球米6在2HG敏感白血病或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。另一項(xiàng)研究報(bào)道，缺氧廣泛地增加了對(duì)mRNA的m6A修飾，導(dǎo)致獲得了更高的mRNA穩(wěn)定性，而不是m6A介導(dǎo)的衰變。這些發(fā)現(xiàn)都表明腫瘤缺氧導(dǎo)致了m6A表觀遺傳重塑，但尚未確定普遍的改變和觸發(fā)這些改變的分子。
   今年11月份，Jiajie Hou等人在Mol Cancer發(fā)表一篇 “YTHDF2 reduction fuels inflammation and vascular abnormalization in hepatocellular carcinoma”的SCI文章。這篇文獻(xiàn)確定了人類肝癌標(biāo)本和缺氧細(xì)胞系中m6A修飾的特征增益與mRNA表達(dá)的增加有關(guān)。在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中，這些“過(guò)度上調(diào)”的基因與癌癥進(jìn)展的分子重排顯著相關(guān)。預(yù)測(cè)HCC（肝癌）患者分類和預(yù)后不良的YTHDF2的減少與這種轉(zhuǎn)錄編排高度相關(guān)，并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步揭示由THDF2的轉(zhuǎn)錄抑制HIF-2α，在腎細(xì)胞癌和肝癌已被應(yīng)用于靶向治療。 HIF-2α拮抗劑（PT2385）的給藥得以恢復(fù)，并需要YTHDF2來(lái)抑制炎癥相關(guān)的癌癥進(jìn)展?？傊?，該文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)了YTHDF2在HCC中具有阻斷低氧誘導(dǎo)的表觀遺傳-炎癥-癌癥軸的保護(hù)作用。
技術(shù)路線：

一、人類HCC在m 6 A-mRNA景觀中表現(xiàn)出“高變”變化

人類HCC中m6A-mRNA的過(guò)度上調(diào)和YTHDF2的下調(diào)。（a）使用LC-MS/MS評(píng)估，成對(duì)的腫瘤和癌旁mRNA中的m6A水平。n=37例患者。（b）通過(guò)MeRIP-Seq測(cè)定，與副腫瘤相比，腫瘤中m6A-mRNA改變的百分比（分類為低表達(dá)，低表達(dá)，高表達(dá)和高表達(dá)）。n=8位患者。（c）通過(guò)RNA-seq確定的配對(duì)腫瘤與副腫瘤mRNA中的缺氧簽名基因表達(dá)的基因集富集分析。n=8位患者。NES，標(biāo)準(zhǔn)化富集得分。（d）米6使用LC-MS/MS評(píng)估，在缺氧條件下生長(zhǎng)0、6、12或24h的人類HCC細(xì)胞系的mRNA表達(dá)水平。n=2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（e）使用MeRIP-Seq檢測(cè)到，缺氧（Hx）與正常氧（Nx）24小時(shí)后，SMMC7721細(xì)胞m6A峰的變化。在P<0.05和5％FDR調(diào)整下，突出顯示（紫色）或丟失（淺藍(lán)色）m6A的峰。（f）在低氧或常氧條件下，不同轉(zhuǎn)錄片段中m6A峰的分?jǐn)?shù)。（g）高甲基化峰中mRNA的表達(dá)變化。（h）YTHDF2在配對(duì)的腫瘤（T）和副腫瘤（P）組織中的免疫印跡。?=7位患者。（i）通過(guò)RT-qPCR評(píng)估的成對(duì)的腫瘤和癌旁組織中的YTHDF2mRNA水平。n=51位患者。（j）散點(diǎn)圖，顯示m6A水平與YTHDF2表達(dá)之間的相關(guān)性。顯示了線性最佳擬合線，皮爾遜相關(guān)系數(shù)（r）和P值（P）。n=37例患者。（k）Kaplan-Meier分析YTHDF2表達(dá)水平與HCC患者的總生存（左）或無(wú)復(fù)發(fā)生存（右）之間的相關(guān)性。n=總共200名患者。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過(guò)兩個(gè)尾部t檢驗(yàn)確定P值

二、YTHDF2與HCC轉(zhuǎn)錄組和臨床結(jié)果相關(guān)

（a）通過(guò)CCK8評(píng)估5d生長(zhǎng)的SMCMC7721-shCtrl和SMMC7721-shYTHDF2細(xì)胞的增殖活性（左），或通過(guò)正常氧（Nx）或缺氧（Hx）的另外24h的生長(zhǎng)并通過(guò)WST1分析評(píng)估的增殖活性（右）。n=4–6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（b）在Nx或Hx下，將HUVEC與所示SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)24h形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（c，d）將指示的SMMC7721（c）或MHCC97H（d）細(xì)胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指定的日期測(cè)量腫瘤體積。?=5–6只老鼠。（e）肺組織的H＆E染色，顯示轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)起源于MHCC97H細(xì)胞。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（f）SMCD7721衍生腫瘤中的微血管密度（MVD），通過(guò)CD31染色和微血管區(qū)域定量評(píng)估。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（克）血管擬態(tài)在MHCC97H衍生的腫瘤，如通過(guò)PAS的數(shù)字量化+CD31-腫瘤細(xì)胞內(nèi)襯通道。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（h-j）肉眼觀察（h），腫瘤數(shù)目（i）和8.5個(gè)月大的注射DEN和CCL4的Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肝臟的最大腫瘤大小。n=7–9只小鼠。（j）Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肺中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的H＆E染色。n=7–9只小鼠。比例尺，50μm。（k）CD31和NG2的免疫熒光染色，顯示Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肝臟中的微血管和周細(xì)胞覆蓋。n=7–9只小鼠。比例尺，50μm。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過(guò)兩個(gè)尾部t檢驗(yàn)確定P值。

三、YTHDF2缺乏癥加劇了炎癥和血管異常

（a）火山圖，顯示了SMMC7721-shYTHDF2與SMMC7721-shCtrl細(xì)胞中（紅色）或（藍(lán)色）下調(diào)的基因，通過(guò)RNA序列評(píng)估。（b）基于（A）中的RNA-seq的GO分析，顯示了最重要的GO項(xiàng)和P值。（c）篩選策略顯示出一組重疊基因，它們?cè)赮THDF2缺陷誘導(dǎo)的上調(diào)和缺氧誘導(dǎo)的上調(diào)同時(shí)發(fā)生。（d，g）顯示在STAT3磷酸化（d）和SerpinE2（g）表達(dá)的指示的SMMC7721細(xì)胞在Nx或Hx下生長(zhǎng)24小時(shí)的免疫印跡。?=2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（e）在Nx或Hx下生長(zhǎng)24h的SMMC7721細(xì)胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相對(duì)mRNA水平的RT-qPCR分析。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（f）在Nx或Hx下生長(zhǎng)24小時(shí)的所指示SMMC7721細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中IL-11的定量蛋白質(zhì)水平的ELISA分析。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（h）如通過(guò)RNA-seq評(píng)估的，在低氧下生長(zhǎng)12小時(shí)的SMMC7721-OE細(xì)胞與SMMC7721-EV細(xì)胞中顯示出上調(diào)（紅色）或下調(diào)（藍(lán)色）的基因的火山圖。（我RT-qPCR分析在Hx下生長(zhǎng)0、6、12或24h的SMMC7721-EV和SMMC7721-OE細(xì)胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相對(duì)mRNA水平。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（j）顯示在指定的SMMC7721細(xì)胞中在Nx或Hx下生長(zhǎng)24小時(shí)的STAT3磷酸化的免疫印跡。n=2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過(guò)兩個(gè)尾部t檢驗(yàn)確定P值。

四、YTHDF2降解m 6含IL11和SERPINE2 mRNA

（a）通過(guò)MeRIP-qPCR評(píng)估，SMMC7721細(xì)胞中表達(dá)空載體（EV）或過(guò)表達(dá)YTHDF2（OE）的IL11和SERPINE2mRNA中的m6A富集。使細(xì)胞經(jīng)受Nx或Hx12小時(shí)。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（b）通過(guò)RIP-qPCR測(cè)定，從SMMC7721-OE細(xì)胞免疫沉淀的YTHDF2-mRNA復(fù)合物中IL11和SERPINE2的基因富集。使細(xì)胞經(jīng)受Nx或Hx12小時(shí)。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（c，d）通過(guò)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)錄抑制（TI）后的轉(zhuǎn)錄物豐度確定，在指定的SMMC7721細(xì)胞中IL11和SERPINE2的RNA壽命。在TI引發(fā)之前，將細(xì)胞進(jìn)行Nx或Hx處理8小時(shí)。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（e）平均讀取密度，顯示使用MeRIP-seq評(píng)估的人HCC組織中IL11和SERPINE2轉(zhuǎn)錄物中鑒定出的m6A峰。n=8位患者。（f）熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，顯示在IL11（左）或SERPINE2（右）3'UTR存在下，YTHDF2對(duì)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。指示的SMMC7721細(xì)胞在Nx或Hx下生長(zhǎng)12小時(shí)。雷尼利亞將螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為螢火蟲活性，并表示為相對(duì)螢光素酶活性。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（g）YTHDF2和DCP1a（P體標(biāo)記）在Nx或Hx下生長(zhǎng)12h的SMMC7721細(xì)胞的免疫熒光染色。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，5μm。（h）在Nx或Hx下生長(zhǎng)12小時(shí)的所示SMMC7721細(xì)胞中IL11或SERPINE2mRNA的熒光原位雜交和DCP1a的免疫熒光染色。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，5μm。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過(guò)兩個(gè)尾部t檢驗(yàn)確定P值

（a）將空載體（EV）或編碼野生型（WT）或突變型YTHDF2的載體（W432A和W486A）轉(zhuǎn)導(dǎo)到具有YTHDF2-敲低（KD）背景的SMMC7721細(xì)胞中。通過(guò)CCK8（左）或WST1分析（右）評(píng)估了指示的SMMC7721細(xì)胞的增殖活性。n=5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（b）通過(guò)HUVEC與指定的SMMC7721細(xì)胞在Nx或Hx下共培養(yǎng)24小時(shí)共培養(yǎng)形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（c）在Nx或Hx下生長(zhǎng)24小時(shí)的SMMC7721細(xì)胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相對(duì)mRNA水平的RT-qPCR分析。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（d）在Nx或Hx下生長(zhǎng)24小時(shí)的指示SMMC7721細(xì)胞中培養(yǎng)上清液中IL-11定量蛋白質(zhì)水平的ELISA分析。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（e）顯示在指定的SMMC7721細(xì)胞中在Nx或Hx下生長(zhǎng)24小時(shí)的STAT3磷酸化和SerpinE2表達(dá)的免疫印跡。n=2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（f）將指示的SMMC7721細(xì)胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指定的日期測(cè)量腫瘤體積。n＝5只小鼠。（克）將靶向IL11和SERPINE2的對(duì)照shRNA或shRNA導(dǎo)入YTHDF2-nockdown（KD）背景的SMMC7721細(xì)胞。通過(guò)CCK8（上）或WST1分析（下）評(píng)估指定的SMMC7721細(xì)胞的增殖活性。n=5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（h）由HUVEC與所示SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（i）將指示的SMMC7721細(xì)胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指示的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量腫瘤體積。n＝5只小鼠。（j）人肝癌組織陣列中IL-11和SerpinE2的免疫組織學(xué)染色，分為YTHDF2低和YTHDF2高根據(jù)YTHDF2的中值綜合光密度（IOD）值進(jìn)行分類。n=143位患者。比例尺，200μm。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過(guò)兩個(gè)尾部t檢驗(yàn)確定P值

五、缺氧以HIF-2α依賴性方式中斷YTHDF2表達(dá)

（a）YTHDF2和pimonidazole（PIMO）在SMMC7721衍生的小鼠腫瘤中的免疫熒光染色。缺氧腫瘤區(qū)域通過(guò)PIMO染色進(jìn)行標(biāo)記。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，20μm。（b）YTHDF2在用對(duì)照siRNA（siCtrl）或靶向HIF-1/2α的siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的SMMC7721細(xì)胞中的免疫印跡，并在Nx或Hx下生長(zhǎng)24小時(shí)。n=2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（c）在Nx或Hx暴露24小時(shí)后，表達(dá)指定siRNA的SMMC7721細(xì)胞中YTHDF2的RT-qPCR分析。（d）富集人缺氧反應(yīng)因子（HREs）的人類Ythdf2片段通過(guò)ChIP-qPCR確定DNA-HIF-2α復(fù)合物中的啟動(dòng)子。n=4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（e）如使用熒光素酶測(cè)定法定量的，在表達(dá)指示的siRNA的SMMC7721細(xì)胞中Ythdf2啟動(dòng)子活性。將海腎熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為螢火蟲活性，并表示為相對(duì)熒光素酶活性。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（f）如通過(guò)WST1測(cè)定所評(píng)估的，用媒介物或PT2385（10μM）處理的所指示的SMMC7721細(xì)胞的增殖活性。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（g）在指定條件下共培養(yǎng)HUVEC形成的內(nèi)皮管的數(shù)量。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（h，j）YTHDF2（h）和p-STAT3（j）在用載體或PT2385（10μM）處理的SMMC7721細(xì)胞中的免疫印跡。n=2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（i）RT11q分析IL11（左）和SERPINE2（右）mRNA水平。n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（k，l）具有SMMC7721-shCtrl（K）或SMMC7721-shYTHDF2（L）細(xì)胞的NPG小鼠在達(dá)到200mm3的平均腫瘤體積后用Vehicle或PT2385（20mg/kg/d）口服處理。在指定的治療日期連續(xù)測(cè)量腫瘤體積。n＝6只小鼠。誤差線表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通過(guò)兩個(gè)尾部t檢驗(yàn)確定P值