國自然熱門領(lǐng)域之m6A

   m6A是一種動態(tài)可逆的修飾方式，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用，其在調(diào)控基因表達(dá)、剪接、RNA 編輯、RNA 穩(wěn)定性、控制mRNA壽命和降解、介導(dǎo)環(huán)狀RNA翻譯等方面扮演重要角色，具有重要的研究意義。國自然基金申請上，m6A RNA甲基化相關(guān)項目增長喜人。2019年有140個中標(biāo)項目與m6A甲基化相關(guān)，較2018年67個中標(biāo)項目，同比增長109%。文章產(chǎn)出上也連年增長，其高質(zhì)量文章不斷?？梢灶A(yù)見在未來三到五年內(nèi)，m6A甲基化仍會是熱門研究領(lǐng)域，且研究產(chǎn)出呈爆炸增長。

   今天我們來講一篇m6A甲基化參與調(diào)節(jié)腫瘤干性和化療敏感性的文章。該文章發(fā)表于Molecular Cancer期刊，期刊影響因子為10.679，該期刊近年來影響因子逐年上漲，質(zhì)量較高。文章題名為：m6A modification-mediated CBX8 induction regulates stemness and chemosensitivity of colon cancer via upregulation of LGR5。該文章講述了m6A修飾后CBX8通過上調(diào)LGR5表達(dá)調(diào)節(jié)結(jié)腸癌（CC）的干性和化療敏感性。

一、CBX8維持CC細(xì)胞的干性
   通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析正常結(jié)腸組織和CC組織中CBX蛋白的mRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)CC組織中CBX2，CBX4和CBX8的表達(dá)顯著上調(diào)。又通過IHC檢測三種蛋白在抗化療CC組織中的表達(dá)，抗化療CC組織中CBX8的表達(dá)高于正常組織。由于化療抗性是癌癥干性的關(guān)鍵特征，因此研究了CBX8對CC細(xì)胞干性特征的影響。相對于正常上皮細(xì)胞系，CBX8在CC細(xì)胞系中過表達(dá)。抑制CBX8可降低CC細(xì)胞初級和次級成球能力；相反，過表達(dá)CBX8增強(qiáng)初級和次級成球能力。腫瘤干性標(biāo)記包括CD133，CD44，LGR5和EpCAM，WB檢測了CBX8對腫瘤肝性標(biāo)記表達(dá)調(diào)控作用。敲低CBX8顯著降低CC細(xì)胞中CD133，LGR5，CD44和EpCAM的表達(dá)，過表達(dá)CBX8顯著增加了CC細(xì)胞中干性標(biāo)志物的表達(dá)。流式檢測到敲低CBX8的CC細(xì)胞減少細(xì)胞中LGR5高表達(dá)的比例，過表達(dá)結(jié)果相反。皮下成瘤實驗中，注射了敲低CBX8基因DLD-1和LoVo細(xì)胞的小鼠的腫瘤發(fā)病率明顯降低。成球?qū)嶒灡砻?，LGR5+細(xì)胞比LGR5-細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的成球能力。LGR5+細(xì)胞有助于小鼠的腫瘤形成，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗細(xì)胞凋亡的能力（通過L-OHP或CPT-11誘導(dǎo)）。

二、CBX8抑制CC細(xì)胞對L-OHP和CPT-11的化療敏感性
   由于敲低CBX8抑制CC細(xì)胞的干性，接下來檢查CBX8是否會影響CC細(xì)胞的化療敏感性。敲低CBX8的CC細(xì)胞在L-OHP和CPT-11處理下，表現(xiàn)出較差的集落形成能力和較高的細(xì)胞凋亡率。過表達(dá)CBX8后，結(jié)果相反。結(jié)果表明，CBX8敲低或過度表達(dá)與化療藥物有協(xié)同作用。為了進(jìn)一步研究CBX8敲低是否影響化療敏感性，通過慢病毒干擾CBX8表達(dá)。結(jié)果表明，敲低CBX8表達(dá)可有效抑制腫瘤生長；shCBX8與L-OHP或CPT-11的結(jié)合對腫瘤生長的抑制作用比任何單獨的治療都要強(qiáng)。IHC結(jié)果確認(rèn)了CBX8的表達(dá)被shCBX8干擾，并且shCBX8與L-OHP或CPT-11的組合促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明病毒介導(dǎo)的CBX8沉默增加了CC細(xì)胞對L-OHP和CPT-11的化療敏感性。

三、LGR5為CBX8的靶標(biāo)并介導(dǎo)CBX8誘導(dǎo)的CC細(xì)胞干性
   通過轉(zhuǎn)錄組測序確定干擾CBX8和對照細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜。敲低CBX8導(dǎo)致2234個基因的上調(diào)和3410個基因的下調(diào)。GSEA分析結(jié)果表明，差異表達(dá)的基因集顯著與癌癥干性和侵襲相關(guān)。使用ChIP-seq方法確定了CC細(xì)胞中CBX8的全基因組靶位，CBX8優(yōu)先分布在基因的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）附近。GO）分析結(jié)果表明，CBX8結(jié)合基因的最重要生物學(xué)功能包括轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，Pol II調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄corepressor活性。分析了敲除CBX8后差異表達(dá)基因與ChIP-seq數(shù)據(jù)之間的重疊基因集，發(fā)現(xiàn)46個上調(diào)基因包含在CBX8目標(biāo)基因集中，而83個下調(diào)基因包含在CBX8目標(biāo)集中基因。重要的是，LGR5位于83個下調(diào)的靶基因中，因此推測CBX8可以參與調(diào)控LGR5。
   為了進(jìn)一步評估LGR5對CBX8介導(dǎo)的干特性的影響，用LGR5過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了CBX8敲低的CC細(xì)胞。LGR5的過表達(dá)恢復(fù)了CBX8耗盡誘導(dǎo)的干標(biāo)記表達(dá)，球體形成能力和對L-OHP和CPT-11的化療敏感性的變化。相反，LGR5敲低挽救了CBX8過表達(dá)誘導(dǎo)的干性標(biāo)記表達(dá)，球體形成能力和化療敏感性的變化。這些結(jié)果證實，CBX8可通過LGR5促進(jìn)癌癥干并抑制化療敏感性。

四、CBX8通過以經(jīng)典途徑與pol II相互作用調(diào)節(jié)LGR5轉(zhuǎn)錄
   接下來，研究了CBX8促進(jìn)LGR5表達(dá)的潛在機(jī)制。qRT-PCR的結(jié)果證實，敲低CBX8導(dǎo)致LGR5表達(dá)降低，而過表達(dá)CBX8導(dǎo)致LGR5表達(dá)升高，表明CBX8在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)了LGR5表達(dá)。ChIP-seq結(jié)果表明，CBX8在LGR5的啟動子上富集。使用MEME來分析識別CBX8的結(jié)合基序，預(yù)測出五個高度相關(guān)結(jié)合序列，其中第四個基序中富含LGR5啟動子，可能在LGR5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用。為了確定是否存在CBX8響應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建了三個熒光素酶報告基因，其中包含LGR5啟動子的不同片段。螢光素酶報告基因分析的結(jié)果表明，CBX8敲低顯著降低了由-591/267片段驅(qū)動的螢光素酶活性；而CBX8過表達(dá)增強(qiáng)了由該片段驅(qū)動的螢光素酶活性。這些結(jié)果證實，CBX8啟動子的-591/267區(qū)含有CBX8響應(yīng)位點。然后，我們構(gòu)建了針對LGR5啟動子不同區(qū)域的七對引物。結(jié)合的ChIP和qPCR分析顯示，CBX8結(jié)合到CBX8啟動子中的區(qū)域2–5，該區(qū)域包括在-591 / 267個片段。Pol II抑制可抑制具有或不具有CBX8過表達(dá)的DLD-1細(xì)胞中的LGR5活化，ChIP-seq數(shù)據(jù)表明LGR5 啟動子中Pol II高度富集，CoIP分析結(jié)果表明CBX8結(jié)合了DLD-1細(xì)胞中的Pol II。敲低或過表達(dá)CBX8，并進(jìn)行ChIP-PCR分析。結(jié)果顯示，敲低CBX8時，CBS2和CBS4上Pol II的占用率降低。相反，在CBX8過表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Pol II在CBS2和CBS4處的占用增加。作者還研究了CBX8是否以經(jīng)典的PRC1依賴性方式促進(jìn)LGR5轉(zhuǎn)錄。為此，敲低DLD-1細(xì)胞中Ring1b的表達(dá)，但Ring1b的敲低并未干擾LGR5的表達(dá)，這表明CBX8介導(dǎo)的LGR5激活不涉及PRC1的經(jīng)典機(jī)制。

五、CBX8通過與KMT2b結(jié)合而在LGR5啟動子上維持H3K4me3
   為了深入了解CBX8調(diào)控LGR5表達(dá)的機(jī)制，使用UCSC確定是否存在組蛋白修飾（H3K4me3、H3K27me、3H3K27Ac）。H3K4me3和H3K27Ac標(biāo)記轉(zhuǎn)錄激活，而H3K27me3標(biāo)記轉(zhuǎn)錄抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高富集的H3K4me3和H3K27me3的峰重疊。ChIP分析用于進(jìn)一步確定CBX8是否通過組蛋白修飾調(diào)節(jié)LGR5。在LGR5啟動子處，CBX8的敲低和過表達(dá)分別降低和增加了H3K4me3的表達(dá)，而CBX8敲低并沒有改變H3K27me3或H3K27Ac的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)暗示在LGR5啟動子上的H3K4me3修飾是CBX8介導(dǎo)的LGR5激活的原因。來自ENCODE的ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示KMT2b富含LGR5啟動子，干擾KMT2b不會降低LGR5表達(dá)。WB結(jié)果顯示，過表達(dá)CBX8并敲低KMT2b-抑制LGR5活化。此外，CoIP檢測結(jié)果顯示CBX8在DLD-1細(xì)胞中與KMT2b相互作用。當(dāng)這些標(biāo)記的蛋白在HEK293細(xì)胞中共表達(dá)時，CoIP鑒定了CBX8和KMT2b之間的相互作用。為了進(jìn)一步評估KMT2b在CBX8介導(dǎo)的LGR5表達(dá)中的作用，我們通過ChIP-qPCR重新檢查了LGR5啟動子的七個區(qū)域，ChIP分析表明，KMT2b在區(qū)域3、5和6中顯著富集。敲低CBX8降低了KBS1和KBS2處KMT2b的結(jié)合率，而KMT2b耗盡抑制了KBS1和KBS2處KMT2b和H3K4me3的富集。這些結(jié)果表明，CBX8導(dǎo)致KBS1和KBS2處的KMT2b積累，以維持H3K4me3修飾狀態(tài)。為了進(jìn)一步確認(rèn)KBS1和KBS2是否是促進(jìn)LGR5表達(dá)的關(guān)鍵位點，我們構(gòu)建了幾種螢光素酶報告基因質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含帶有或不帶有KBS1和KBS2突變的各種啟動子區(qū)域。當(dāng)KBS1或KBS2發(fā)生突變或KBS2被刪除時，CBX8基因敲除和過表達(dá)分別降低和增加報告基因活性。在LGR5啟動子中構(gòu)建了KBS1突變和KBS2缺失的質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)CBX8的敲除和過表達(dá)都不會影響報告基因的活性。這些結(jié)果表明，在CC細(xì)胞中，CBX8將KMT2b募集到KBS1和KBS2，從而通過H3K4me3促進(jìn)LGR5轉(zhuǎn)錄。
   為了鑒定CBX8與KMT2b結(jié)合的結(jié)合域，我們克隆了5個帶有Flag標(biāo)簽的CBX8構(gòu)建體，并用截短的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了DLD-1細(xì)胞。用抗-Flag抗體對細(xì)胞提取物進(jìn)行IP。Flag-CB4與癌細(xì)胞中的KMT2b相互作用，表明與KMT2b相互作用需要CBX8氨基酸214和300之間的結(jié)構(gòu)域。

六、Mettl3誘導(dǎo)的m 6 A修飾參與CBX8的上調(diào)
   導(dǎo)致CBX8異常表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。RMBase預(yù)測顯示，許多高度可信的m6A位點分布在CBX8 mRNA中，因此推測CBX8的上調(diào)是否依賴于m6A修飾。MeRIP與qRT-PCR結(jié)合顯示，DLD-1和SW480細(xì)胞中m6A的富集程度明顯高于正常NCM460細(xì)胞。TCGA數(shù)據(jù)庫中評估了Mettl3表達(dá)以及Mettl3和CBX8表達(dá)之間的相關(guān)性。值得注意的是，Mettl3在CC組織中顯著上調(diào)，并且Mettl3表達(dá)與CBX8表達(dá)正相關(guān)。敲低Mettl3明顯降低了CBX8 mRNA和蛋白質(zhì)水平，相反，過表達(dá)Mettl3增加了CBX8的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。MeRIP PCR也表明，敲低Mettl3降低CBX8 mRNA的m6A甲基化水平。敲低Mettl3導(dǎo)致CBX8 mRNA的穩(wěn)定性降低，而Mettl3過表達(dá)則可以提高CBX8 mRNA的穩(wěn)定性。這些結(jié)果揭示了Mettl3通過促進(jìn)CC細(xì)胞中的m6A修飾來維持CBX8 mRNA的穩(wěn)定性。
使用RMBase 預(yù)測了CBX8 m 6 A位點的潛在讀者，發(fā)現(xiàn)IGF2BP1確實在CBX8 mRNA上具有結(jié)合位點。RIP分析證實了CC細(xì)胞中IGF2BP1和CBX8 mRNA之間存在直接相互作用，敲低IGF2BP1會顯著降低CBX8蛋白表達(dá)水平。敲低IGF2BP1后，CBX8 mRNA的中位半衰期明顯縮短；敲低Mettl3后，IGF2BP1和CBX8 mRNA之間的相互作用受到損害。這些數(shù)據(jù)表明，IGF2BP1與CBX6 mRNA結(jié)合，以m6A依賴的方式增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

七、CC中Mettl3 / CBX8 / LGR5軸的臨床意義
   qRT-PCR和WB驗證臨床CC樣本中CBX8表達(dá)，IHC結(jié)果證實高表達(dá)CBX8主要定位于在CC組織細(xì)胞核?；瘜W(xué)抗性CC組織中的CBX8表達(dá)高于化學(xué)敏感的CC組織。數(shù)據(jù)庫分一下預(yù)后相關(guān)性和生存曲線。IHC結(jié)果顯示，化療抗性患者CBX8，Mettl3，LGR5，CD133和CD44表達(dá)水平較高。

    最后今天就看到這里，下回帶大家看點別的，再見??！