乳腺癌中KLK6蛋白酶介導(dǎo)的生化途徑

   激肽釋放酶相關(guān)的肽酶6（KLK6）是一種絲氨酸蛋白酶，通常在乳腺組織中表達(dá)，在乳腺癌中受到異常調(diào)節(jié)。在生理水平上，KLK6發(fā)揮乳腺癌的抑制作用，而其異常的過表達(dá)（比正常水平高50倍以上）是一部分乳腺癌的特征，并與嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷小鼠的原發(fā)性乳腺腫瘤的加速生長有關(guān)。
主要結(jié)果如下：
1、實驗設(shè)計
   實驗設(shè)計中作者選擇了其本身不表達(dá)KLK6且重表達(dá)KLK6也不降低其它KLKs表達(dá)的細(xì)胞系MDA-MB-231為親本。C5為KLK6,C21與侵襲表型相關(guān)，可見KLK6對MDA-MB-231細(xì)胞致瘤表型呈現(xiàn)出劑量依賴性規(guī)律(圖1B–D)。尾靜脈實驗顯示，C5細(xì)胞向肺轉(zhuǎn)移的效率與PAR細(xì)胞相似，而C28細(xì)胞不轉(zhuǎn)移(圖1E)，KLK6影響乳腺癌細(xì)胞的肺部定值也表現(xiàn)出劑量依賴性。

                                   圖1 劑量依賴性的KLK6表達(dá)恢復(fù)降低了MDA-MB-231細(xì)胞的體內(nèi)和體外外致瘤性

2、蛋白組學(xué)表達(dá)譜
   MDA-MB-231為親本（PAR），C5為KLK6高表達(dá)細(xì)胞系，C28為KLK6生理正常表達(dá)細(xì)胞系。C28的平均光譜計數(shù)為24.94，C5的平均光譜計數(shù)為16.54，PAR的平均光譜計數(shù)為20.56。從這三個樣本中共計鑒定出3639個蛋白質(zhì)，而三個樣本共有的蛋白質(zhì)為2449（圖2A, B）。三個樣本中蛋白質(zhì)的數(shù)量分別為：PAR有3628個，C28有3312，C5有2731個。以95%的概率統(tǒng)計，共有1814個蛋白同時存在于三個樣本中（圖2C）。C5和C28中發(fā)現(xiàn)的蛋白相對于PAR的相對表達(dá)水平如圖2D所示，蛋白表達(dá)改變可以分為三個類別：與KLK6表達(dá)水平無關(guān)的蛋白；表達(dá)量呈KLK6濃度依賴性下降或上升的蛋白；表達(dá)受KLK6影響呈現(xiàn)鐘形表達(dá)的蛋白質(zhì)。最后一類可以解釋為什么當(dāng)在相對于過表達(dá)的生理水平上重新表達(dá)時，KLK6對MDA-MB-231表型產(chǎn)生不同的作用。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果通過p53，p65，α-微管蛋白和消去蛋白的WB得到驗證（圖2E）。

                                           圖2 MDA-MB-231細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)特征

   然后，作者使用IPA分析了C5和PAR或C28和PAR之間差異倍數(shù)大于4倍的蛋白質(zhì)以尋找在C5和C28細(xì)胞之間差異激活或失活的途徑（圖3）。

                                                    圖3 分子途徑

3、KLK6在生理水平上的重新表達(dá)降低了S100蛋白的表達(dá)
   S100A蛋白在C28細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而在C5、S100A4和S100A11細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(圖4A)。S100蛋白相對于KLK6表達(dá)的鐘形表達(dá)模式可以解釋為什么C5細(xì)胞與C28相比具有向肺轉(zhuǎn)移的能力。對KLK6的表達(dá)與S100蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了臨床探索，生理性KLK6水平與S100A11和S100A14呈負(fù)相關(guān)（圖4B，C）。而在基底樣癌中，KLK6與S100A11和S100A2呈正相關(guān)（圖4B，C）。

                                             圖4 KLK6影響S100A蛋白的水平

4、生理水平的KLK6可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
   C28細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，C5細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)(圖5)。凋亡介導(dǎo)蛋白（例如CASP8和CASP7）在C28細(xì)胞中表達(dá)的增加可能是其致瘤性降低的原因。乳腺癌臨床數(shù)據(jù)集分析顯示，KLK6表達(dá)與BCL成員表達(dá)具有相關(guān)性(圖5)。

                                           圖5 KLK6影響與凋亡相關(guān)的基因

5、KLK6的重新表達(dá)降低了RAB蛋白的表達(dá)
   RABs是調(diào)節(jié)囊泡運輸和細(xì)胞內(nèi)通訊的細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)鞍?。由于異常的轉(zhuǎn)運與細(xì)胞極性的喪失、增殖的增加、細(xì)胞的運動和侵襲有關(guān)，因此囊泡轉(zhuǎn)運對上皮細(xì)胞的癌變具有重要意義。MDA-MB-231中RABs的表達(dá)具有較高的異質(zhì)性：部分RABs成員表達(dá)在C28中略有下降，在C5細(xì)胞中表下降顯著，而其他RABs成員在C5和C28細(xì)胞中均有升高(圖6)。RAB表達(dá)的變化表明C5和C28細(xì)胞中的小泡運輸重組，并且RAB在C5中顯著下調(diào)但在C28中幾乎保持不變（圖6中的陰影框），這可能與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和致瘤性有關(guān)。乳腺癌臨床數(shù)據(jù)集分析顯示，KLK6表達(dá)與RAB26、RAB17和RAB30呈負(fù)相關(guān)(圖6)。

                                            圖6 KLK6影響RAB蛋白的表達(dá)

6、KLK6與多種角蛋白協(xié)同表達(dá)
   角蛋白(KRTs)參與EMT，可能參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。作者發(fā)現(xiàn)C5和C28細(xì)胞中KRT8和KRT18的上調(diào)，這與恢復(fù)MDA-MB-231中KLK6表達(dá)后誘導(dǎo)的間質(zhì)到上皮的轉(zhuǎn)變有關(guān)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)KRT81在過表達(dá)KLK6的C5細(xì)胞中上調(diào)，在低表達(dá)KLK6的C28細(xì)胞中下調(diào)。 該發(fā)現(xiàn)的生理學(xué)意義尚不清楚，但可能表明KRT81促進(jìn)腫瘤發(fā)生。 乳腺癌臨床數(shù)據(jù)分析表明，KRT表達(dá)與KLK6相關(guān)（正向或反向），包括KLK6和KRT18的反向相關(guān)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)KLK6的重表達(dá)導(dǎo)致MDA-MB-231中核糖體蛋白水平降低，并引起了分泌金屬蛋白酶活性的變化。

7、生存分析
   使用兩個綜合評分分析，即KLK6 + S100B-S100A7和KLK6 + S100B-S100A14-S100A16，以預(yù)測乳腺癌患者的長期生存（圖7A，B）。對于KLK6 + S100B-S100A7而言，得分低的乳腺癌患者比得分較高的乳腺癌患者有更長的生存期。因此，可以利用這種評分模式尋找診斷應(yīng)用的方法。

                                              圖7 總體生存(OS)評分
   綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)KLK6對乳腺原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有濃度依賴性。具體來說，當(dāng)KLK6的表達(dá)水平與正常乳腺細(xì)胞分泌的水平相當(dāng)時，它可在體內(nèi)抑制原發(fā)腫瘤的形成和肺轉(zhuǎn)移。另一方面，KLK6過表達(dá)是乳腺癌的一個亞型，它促進(jìn)了體內(nèi)原發(fā)性腫瘤的發(fā)生和肺轉(zhuǎn)移。此外，本文也是首次將KLK6的致瘤性與S100A和凋亡介導(dǎo)蛋白的表達(dá)聯(lián)系起來的研究。
參考文獻(xiàn)：
   Pampalakis Georgios., Zingkou Eleni., Sidiropoulos Konstantinos Gus., Diamandis Eleftherios P., Zoumpourlis Vassilis., Yousef George M., Sotiropoulou Georgia., (2019). Biochemical pathways mediated by KLK6 protease in breast cancer. Mol Oncol, 13, 2329-2343.