新認(rèn)識——炎癥如何改變干細(xì)胞外泌體介導(dǎo)的心臟修復(fù)

   心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因，而干細(xì)胞療法在缺血性心臟修復(fù)和再生方面具有廣闊的前景。骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）已進(jìn)入臨床試驗，并顯示出希望而溫和的結(jié)果。EPC/干細(xì)胞在心肌中的存活率低和整合度低，缺血性心臟病后炎癥的長期和未解決也顯著損害了EPC的表型，并可能損害了其在心肌修復(fù)中的修復(fù)功能。有證據(jù)表明，心肌梗死（MI）后幾乎五分之一的患者受到嚴(yán)重全身性炎癥并發(fā)癥和更高死亡風(fēng)險的影響?；颊叩娜硇匝装Y的特征在于循環(huán)中促炎細(xì)胞因子TNF-α的水平較高，而抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平較低。這些患者的EPC功能失調(diào)，細(xì)胞存活，遷移和血管生成活性降低。了解炎癥刺激如何調(diào)節(jié)EPC行為對于適當(dāng)及時地遏制和消除炎癥從而增強基于EPC/祖細(xì)胞的心肌修復(fù)和再生至關(guān)重要。
   最近的研究表明干細(xì)胞介導(dǎo)的心肌修復(fù)在很大程度上與旁分泌作用有關(guān)。外來體最近被鑒定為干細(xì)胞的主要旁分泌功能單位。外泌體從所有類型的細(xì)胞中分泌出來，并含有細(xì)胞特有的小RNA和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)在很大程度上決定著外泌體的功能。干細(xì)胞衍生的外泌體顯示出類似于其親代細(xì)胞本身的心臟修復(fù)和再生特性。但是，所有外泌體，即使是由相同細(xì)胞分泌的，也不是相等的。已知不同的病理生理條件和親代細(xì)胞的刺激會改變外泌體含量并可能調(diào)節(jié)外泌體功能。我們先前使用模仿系統(tǒng)性炎癥條件的IL-10敲除小鼠進(jìn)行的研究表明，IL-10缺陷的EPC分泌的外泌體缺乏體外促進(jìn)細(xì)胞存活，遷移和血管生成的能力，其貨物顯示出差異的蛋白質(zhì)和RNA表達(dá)模式。但是，全身性炎癥如何導(dǎo)致EPC外泌體功能障礙尚不清楚。對于外泌體操縱以及這種無細(xì)胞療法在心血管疾病中的應(yīng)用，了解外泌體功能/功能障礙的分子機制非常重要。
   整聯(lián)蛋白激酶（ILK）廣泛分布于哺乳動物組織中，但其在心臟中的最高表達(dá)提示其在心臟功能調(diào)節(jié)中的重要作用。作為Akt和GSK3β途徑的上游分子，它在細(xì)胞存活和增殖中起作用，而在心肌細(xì)胞中，它似乎是促肥大性，促纖維化，促炎和它是在心臟衰老過程中誘導(dǎo)的。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ILK高度富含IL-10KO-EPC衍生的外泌體和TNFα治療的小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體，表明其在外泌體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。我們的研究探索了外泌體遞送的ILK在受體細(xì)胞中NF-κB活化中的作用，以及富含ILK的外泌體如何參與炎癥反應(yīng)，以及外泌體中ILK的抑制是否可以挽救發(fā)炎的EPC來源的外泌體的心肌修復(fù)能力。
   今年12月，Yue Y等人在Circ Res發(fā)表一篇 “Interleukin-10 Deficiency Alters Endothelial Progenitor Cell -Derived Exosome Reparative Effect on Myocardial Repair via Integrin-Linked Kinase Enrichment.”的SCI文章。這篇文獻(xiàn)作者使用白細(xì)胞介素 10（IL-10）敲除（KO）小鼠模擬系統(tǒng)性炎癥條件，比較了從野生型 EPC 和 IL-10KO-EPC 分離的外泌體的治療效果和蛋白質(zhì)差異。這篇文獻(xiàn)通過質(zhì)譜分析顯示 WT-EPC-Exo和 IL-10KO-EPC-Exo 包含不同的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。作者確定了 ILK 通過激活 NF-κB 途徑在 EPC-外來體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的重要作用。作者進(jìn)一步報告，敲低發(fā)炎外泌體中的 ILK 會減弱 ILK 富集的外泌體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制 NF-κB 途徑的活化并增強缺血性心臟中 EPC 衍生的外泌體的修復(fù)活性。
一、IL10KO EPC的外泌體在功能上是惰性的

A 和 B， MI 后不同時間點的回聲分析。 WT EPC-Exo 處理的小鼠的EF％ 和FS ％均有明顯改善。IL10KO-EPC-Exo 處理的小鼠的心臟功能未顯示任何改善。C 和 D，第 5天心臟樣品的 TUNEL 分析用于 MI 細(xì)胞凋亡后的測量，顯示 IL-10KO-EPC-Exo 處理的小鼠的凋亡細(xì)胞增強。E 和 F，在第 31 天用于心梗后疤痕測量的心臟樣品的 Masson 三色染色顯示，IL10-KOEPC-Exo 組的梗死面積更大。G 和 H，在第 31 天心臟進(jìn)行 CD31 染色，以測量 MI 后的血管生成。
結(jié)論：與表現(xiàn)出修復(fù)活性的 WT EPC 外泌體相比， IL-10 缺陷型 EPC 的外泌體失去了心肌修復(fù)，血管生成和細(xì)胞存活的活性。

二、IL-10KO-EPC-Exo 和 MCEC +TNFα-Exo 中的 ILK 富集

A，質(zhì)譜分析的散點圖顯示 WT-EPC Exo 和 IL-10KO-EPC-Exo 中的蛋白質(zhì)表達(dá)模式不同。 B，關(guān)于在 IL-10KO-EPC-Exo 中過表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因本體分析，用于生物過程鑒定。 C 和 D， Western 印跡分析驗證了 IL-10KO-EPC-Exo 和MCEC +TNFα-Exo 中的 ILK 富集（* vs MCEC-Exo， N = 5， * p = 0.0368， #vs WT-EPC-Exo， N = 3， ## p = 0.0087） 。
結(jié)論：炎癥刺激改變了細(xì)胞來源的外泌體蛋白含量，并且 ILK 通常富含發(fā)炎的外泌體，表明其在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的潛在作用。

三、富含 ILK 的外泌體激活受體細(xì)胞中的 NF-κB 途徑

A 和 B，NF-κB 染色分析顯示 MCEC +TNFα-Exo 和 TNFα處理均觸發(fā)了受體 MCEC 細(xì)胞中的 NF-κB 核易位。  

A 和 B，蛋白質(zhì)印跡顯示 MCEC +TNFα-Exo 和 TNFα激活的 NF-κB信號通路，降低了受體 MCEC 細(xì)胞中 IκBα的表達(dá)。（N = 3， * p = 0.0399， ** p = 0.0066，＃p = 0.0308， ## p = 0.0018） C， qRT-PCR 分析顯示 MCEC +TNFα-Exo 處理 24 小時觸發(fā)了受體 MCEC 中的 NF-κB下游基因表達(dá)細(xì)胞。 (N=4, *p=0.0250, ***p=0.0009);* vs PBS 組#vs MCEC-Exo 組（## p = 0.0047）
結(jié)論：富含 ILK 的外泌體激活受體細(xì)胞中的 NFκB 途徑，并通過增強炎癥基因表達(dá)而增強了炎癥反應(yīng)

四、ILK 敲低外泌體顯示減弱的 NF-κB 激活作用

A 和 B， NF-κB 染色分析表明， ILK KD-Exo 短時治療未激活核 NF-κB易位，但長時間治療后被激活。

A 和 B， Western 印跡顯示， ILK KD-Exo 處理可在短時間內(nèi)抑制 IκBα 的降解。C，qRT-PCR 分析表明 ILK KD-Exo 處理 24h 的水平較低NFκB 下游基因的表達(dá)。
結(jié)論：富含 ILK 的外泌體通過 NFκB 激活激活受體細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。在外泌體中阻斷 ILK 可成功抑制受體細(xì)胞中的 NFκB 活化和炎癥反應(yīng)。

五、MCEC +TNFα -Exo 中的 ILK 抑制可挽救血管生成功能障礙

A 和 B， MCEC +TNFα -Exo 抑制了管的形成，而外泌體中的 ILK 抑制則減弱了抑制作用。

六、IL-10KO-EPC-Exo 中的 ILK 抑制可挽救心臟修復(fù)和再生功能障礙

A 和 B，隨后進(jìn)行回聲分析一個月，EF 和 FS 用于左心室心臟功能測量
結(jié)論：ILK 敲除成功地挽救了 IL-10 缺乏/炎癥誘導(dǎo)的心肌修復(fù)中EPC 外泌體功能障礙。