新認識——炎癥如何改變干細胞外泌體介導(dǎo)的心臟修復(fù)

   心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因，而干細胞療法在缺血性心臟修復(fù)和再生方面具有廣闊的前景。骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞（EPC）已進入臨床試驗，并顯示出希望而溫和的結(jié)果。EPC/干細胞在心肌中的存活率低和整合度低，缺血性心臟病后炎癥的長期和未解決也顯著損害了EPC的表型，并可能損害了其在心肌修復(fù)中的修復(fù)功能。有證據(jù)表明，心肌梗死（MI）后幾乎五分之一的患者受到嚴重全身性炎癥并發(fā)癥和更高死亡風(fēng)險的影響?；颊叩娜硇匝装Y的特征在于循環(huán)中促炎細胞因子TNF-α的水平較高，而抗炎細胞因子IL-10的水平較低。這些患者的EPC功能失調(diào)，細胞存活，遷移和血管生成活性降低。了解炎癥刺激如何調(diào)節(jié)EPC行為對于適當及時地遏制和消除炎癥從而增強基于EPC/祖細胞的心肌修復(fù)和再生至關(guān)重要。
   最近的研究表明干細胞介導(dǎo)的心肌修復(fù)在很大程度上與旁分泌作用有關(guān)。外來體最近被鑒定為干細胞的主要旁分泌功能單位。外泌體從所有類型的細胞中分泌出來，并含有細胞特有的小RNA和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)在很大程度上決定著外泌體的功能。干細胞衍生的外泌體顯示出類似于其親代細胞本身的心臟修復(fù)和再生特性。但是，所有外泌體，即使是由相同細胞分泌的，也不是相等的。已知不同的病理生理條件和親代細胞的刺激會改變外泌體含量并可能調(diào)節(jié)外泌體功能。我們先前使用模仿系統(tǒng)性炎癥條件的IL-10敲除小鼠進行的研究表明，IL-10缺陷的EPC分泌的外泌體缺乏體外促進細胞存活，遷移和血管生成的能力，其貨物顯示出差異的蛋白質(zhì)和RNA表達模式。但是，全身性炎癥如何導(dǎo)致EPC外泌體功能障礙尚不清楚。對于外泌體操縱以及這種無細胞療法在心血管疾病中的應(yīng)用，了解外泌體功能/功能障礙的分子機制非常重要。
   整聯(lián)蛋白激酶（ILK）廣泛分布于哺乳動物組織中，但其在心臟中的最高表達提示其在心臟功能調(diào)節(jié)中的重要作用。作為Akt和GSK3β途徑的上游分子，它在細胞存活和增殖中起作用，而在心肌細胞中，它似乎是促肥大性，促纖維化，促炎和它是在心臟衰老過程中誘導(dǎo)的。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ILK高度富含IL-10KO-EPC衍生的外泌體和TNFα治療的小鼠心臟內(nèi)皮細胞衍生的外泌體，表明其在外泌體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。我們的研究探索了外泌體遞送的ILK在受體細胞中NF-κB活化中的作用，以及富含ILK的外泌體如何參與炎癥反應(yīng)，以及外泌體中ILK的抑制是否可以挽救發(fā)炎的EPC來源的外泌體的心肌修復(fù)能力。
   今年12月，Yue Y等人在Circ Res發(fā)表一篇 “Interleukin-10 Deficiency Alters Endothelial Progenitor Cell -Derived Exosome Reparative Effect on Myocardial Repair via Integrin-Linked Kinase Enrichment.”的SCI文章。這篇文獻作者使用白細胞介素 10（IL-10）敲除（KO）小鼠模擬系統(tǒng)性炎癥條件，比較了從野生型 EPC 和 IL-10KO-EPC 分離的外泌體的治療效果和蛋白質(zhì)差異。這篇文獻通過質(zhì)譜分析顯示 WT-EPC-Exo和 IL-10KO-EPC-Exo 包含不同的蛋白質(zhì)表達模式。作者確定了 ILK 通過激活 NF-κB 途徑在 EPC-外來體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的重要作用。作者進一步報告，敲低發(fā)炎外泌體中的 ILK 會減弱 ILK 富集的外泌體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制 NF-κB 途徑的活化并增強缺血性心臟中 EPC 衍生的外泌體的修復(fù)活性。
一、IL10KO EPC的外泌體在功能上是惰性的

A 和 B， MI 后不同時間點的回聲分析。 WT EPC-Exo 處理的小鼠的EF％ 和FS ％均有明顯改善。IL10KO-EPC-Exo 處理的小鼠的心臟功能未顯示任何改善。C 和 D，第 5天心臟樣品的 TUNEL 分析用于 MI 細胞凋亡后的測量，顯示 IL-10KO-EPC-Exo 處理的小鼠的凋亡細胞增強。E 和 F，在第 31 天用于心梗后疤痕測量的心臟樣品的 Masson 三色染色顯示，IL10-KOEPC-Exo 組的梗死面積更大。G 和 H，在第 31 天心臟進行 CD31 染色，以測量 MI 后的血管生成。
結(jié)論：與表現(xiàn)出修復(fù)活性的 WT EPC 外泌體相比， IL-10 缺陷型 EPC 的外泌體失去了心肌修復(fù)，血管生成和細胞存活的活性。

二、IL-10KO-EPC-Exo 和 MCEC +TNFα-Exo 中的 ILK 富集

A，質(zhì)譜分析的散點圖顯示 WT-EPC Exo 和 IL-10KO-EPC-Exo 中的蛋白質(zhì)表達模式不同。 B，關(guān)于在 IL-10KO-EPC-Exo 中過表達的蛋白質(zhì)的基因本體分析，用于生物過程鑒定。 C 和 D， Western 印跡分析驗證了 IL-10KO-EPC-Exo 和MCEC +TNFα-Exo 中的 ILK 富集（* vs MCEC-Exo， N = 5， * p = 0.0368， #vs WT-EPC-Exo， N = 3， ## p = 0.0087） 。
結(jié)論：炎癥刺激改變了細胞來源的外泌體蛋白含量，并且 ILK 通常富含發(fā)炎的外泌體，表明其在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的潛在作用。

三、富含 ILK 的外泌體激活受體細胞中的 NF-κB 途徑

A 和 B，NF-κB 染色分析顯示 MCEC +TNFα-Exo 和 TNFα處理均觸發(fā)了受體 MCEC 細胞中的 NF-κB 核易位。  

A 和 B，蛋白質(zhì)印跡顯示 MCEC +TNFα-Exo 和 TNFα激活的 NF-κB信號通路，降低了受體 MCEC 細胞中 IκBα的表達。（N = 3， * p = 0.0399， ** p = 0.0066，＃p = 0.0308， ## p = 0.0018） C， qRT-PCR 分析顯示 MCEC +TNFα-Exo 處理 24 小時觸發(fā)了受體 MCEC 中的 NF-κB下游基因表達細胞。 (N=4, *p=0.0250, ***p=0.0009);* vs PBS 組#vs MCEC-Exo 組（## p = 0.0047）
結(jié)論：富含 ILK 的外泌體激活受體細胞中的 NFκB 途徑，并通過增強炎癥基因表達而增強了炎癥反應(yīng)

四、ILK 敲低外泌體顯示減弱的 NF-κB 激活作用

A 和 B， NF-κB 染色分析表明， ILK KD-Exo 短時治療未激活核 NF-κB易位，但長時間治療后被激活。

A 和 B， Western 印跡顯示， ILK KD-Exo 處理可在短時間內(nèi)抑制 IκBα 的降解。C，qRT-PCR 分析表明 ILK KD-Exo 處理 24h 的水平較低NFκB 下游基因的表達。
結(jié)論：富含 ILK 的外泌體通過 NFκB 激活激活受體細胞的炎癥反應(yīng)。在外泌體中阻斷 ILK 可成功抑制受體細胞中的 NFκB 活化和炎癥反應(yīng)。

五、MCEC +TNFα -Exo 中的 ILK 抑制可挽救血管生成功能障礙

A 和 B， MCEC +TNFα -Exo 抑制了管的形成，而外泌體中的 ILK 抑制則減弱了抑制作用。

六、IL-10KO-EPC-Exo 中的 ILK 抑制可挽救心臟修復(fù)和再生功能障礙

A 和 B，隨后進行回聲分析一個月，EF 和 FS 用于左心室心臟功能測量
結(jié)論：ILK 敲除成功地挽救了 IL-10 缺乏/炎癥誘導(dǎo)的心肌修復(fù)中EPC 外泌體功能障礙。