新發(fā)現(xiàn)-納米微球治療結(jié)腸炎

   炎癥性腸?。↖BD）是一類發(fā)病機制尚不清楚的慢性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。其臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和粘液膿血便等癥狀。近年來其發(fā)病率在我國快速增長，2015年時我國患病人數(shù)已達到35萬，近十年患者人數(shù)增長24倍。由于缺乏有效的治療藥物，IBD是不可治愈的疾病。隨著病情的發(fā)展可以引起腸道致殘性改變，包括腸穿孔、腸梗阻和腸癌等，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。
   在炎癥反應(yīng)過程中，腸黏膜屏障破壞，病原微生物進入固有層，激活固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)又會進一步破壞腸上皮的組織結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致更多的病原菌進入固有層，加劇炎癥反應(yīng)。目前，關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎的研究主要集中在免疫細(xì)胞過度激活的調(diào)控機制上。然而，腸道上皮在炎癥反應(yīng)中的功能和作用長期被人們忽視。
   2019年2月16日，《Gastroenterology》（IF=20.773）雜志發(fā)表“MicroRNA-31 Reduces Inflammatory Signaling and Promotes Regeneration in Colon Epithelium, and Delivery of Mimics in Microspheres Reduces Colitis in Mice”文章，此報道首次發(fā)現(xiàn)了炎癥信號在結(jié)腸炎中可以激活腸上皮細(xì)胞的“自我修復(fù)”機制，即受炎癥信號誘導(dǎo)的一種短核苷酸片段microRNA—miR-31負(fù)反饋地抑制上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)同時促進上皮再生；并建立了一種適合直腸給藥的miR-31納米-微球體藥物，非常顯著地預(yù)防和治療了結(jié)腸炎。

   此研究路線圖-促炎癥因子受體IL-17R和受體結(jié)合蛋白Gp130負(fù)反饋抑制炎癥反應(yīng)，并通過激活WNT和抑制Hippo信號通路促進腸上皮再生過程。miR-31模擬物納米-微球體藥物可以顯著促進在炎癥反應(yīng)中損傷上皮的修復(fù)過程。
一、MIR31在IBD發(fā)炎的黏膜中表達增加，并受STAT3和NF-kB信號通路的調(diào)節(jié)

   結(jié)腸炎（IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩疾病（CD）;葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠實驗性結(jié)腸炎;炎癥性腸粘膜中MIR31表達水平與UC患者C反應(yīng)蛋白，紅細(xì)胞沉降率，Mayo評分和UC內(nèi)鏡嚴(yán)重程度指數(shù)以及C反應(yīng)蛋白，紅細(xì)胞值呈正相關(guān)。CD患者中C反應(yīng)蛋白，紅細(xì)胞沉降率，CD活性指數(shù)和CD的簡單內(nèi)鏡評分值分別與MIR31表達水平呈正相關(guān)（圖1C和D）。DSS治療后發(fā)炎的結(jié)腸中MIR31的急劇上調(diào)（圖1E和F）。在經(jīng)過5天的脈沖后停藥2天后，MIR31表達迅速下降，恢復(fù)到治療前的基線（圖1E）。綜上所述，MIR31主要在結(jié)腸上皮細(xì)胞中表達。在白細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中也觀察到了DSS誘導(dǎo)的MIR31表達上調(diào)（補充圖1B）。MIR31的啟動子中鑒定了1個STAT3和2個NF-kB結(jié)合位點（補充圖1C）。

二、MIR31的丟失會加劇炎癥反應(yīng)并延遲上皮再生

   MIR31缺失對結(jié)腸的影響.補充圖結(jié)果：通過同時使用MIR31種系敲除（KO）和Villin Cre驅(qū)動的結(jié)腸上皮條件性KO（cKO）小鼠（補充圖2A）。與對照組相比，MIR31 KO和cKO小鼠的結(jié)腸長度沒有明顯改變（補充圖2B）。隱窩細(xì)胞增殖，尖端細(xì)胞凋亡，或野生型（WT）和KO小鼠之間的杯狀細(xì)胞數(shù)（補充圖2C–I）在飲用水中施用DSS，可減輕WT和MIR31 KO小鼠的結(jié)腸炎。給予DSS 5天，然后恢復(fù)3天。 DSS治療4天后，MIR31 /小鼠的體重減輕比野生型小鼠明顯多，并且在治療終止時體重沒有恢復(fù)（圖2A）。與對照相比，存活率降低（圖2B），較短的結(jié)腸長度（圖2C和D），較大的脾臟（圖2C和D）和較高的臨床疾病評分（圖2E）。時程分析顯示嚴(yán)重發(fā)炎在MIR31 /小鼠中對DSS治療的運動反應(yīng)和DSS去除后再生反應(yīng)受損。

   DSS治療后MIR31 /小鼠中增強的免疫反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)增加DSS治療的MIR31 /小鼠中白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量（圖3A和B），促炎細(xì)胞因子和炎癥小體成分的水平增加以及炎性抑制劑IL10的水平降低（圖3C–G）。促炎NF-kB和STAT3信號通路在MIR31 /小鼠中被過度激活（圖3H和I）。綜上所述，MIR31的丟失導(dǎo)致免疫反應(yīng)亢進進行DSS治療。

三、MIR31直接抑制Il6st（編碼GP130），Il7r，和Il17ra在結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)

   RNA和DSS處理后，MIR31 /小鼠結(jié)腸中Il6st，Il7r和Il17ra的蛋白質(zhì)水平顯著升高（圖4A和B）。DSS治療5天后，MIR31 /結(jié)腸中GP130 GP，IL7Rt和IL17RAt細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（圖4C–F）。體外分析顯示，MIR31模擬物抑制了Il6st，Il7r和Il17ra的表達，而MIR31抑制劑則促進了它們的上調(diào)（圖4G），表明這些推定的靶基因受MIR31以細(xì)胞自主方式調(diào)節(jié)。 3’端UTR-熒光素酶波特試驗顯示，MIR31模擬物顯著抑制了WT Il6st，Il7r和Il17ra 3?UTR活性，但對MIR31結(jié)合位點發(fā)生突變的報告基因沒有明顯影響（圖4H和補充圖9B）。在DSS處理過程中，Il6st，Il7r和Il17ra的表達下降（圖4I和J），與MIR31水平成反比。這些MIR31靶基因的上調(diào)在cKO結(jié)腸中得到進一步證實（圖4K和L）。在人UC組織中GP130表達降低（圖4M）?？傊?， Il6st，Il7r和Il17ra的轉(zhuǎn)錄本是MIR31的直接靶點，并且它們的調(diào)節(jié)可能會影響MIR31在抑制腸粘膜免疫反應(yīng)中的作用。

   WT小鼠的結(jié)腸上皮均激活了報告基因活性，而在MIR31中其報告活性明顯降低/結(jié)腸（圖5A和補充圖11A）。，DSS后RNA和蛋白質(zhì)水平在MIR31 /小鼠結(jié)腸中均顯著降低了Ctnnb1（編碼b-catenin）和WNT靶基因Ccnd1（編碼cyclin D1）和Axin2的表達水平治療（圖5B和補充圖11B）。在5個月后MIR31 /小鼠結(jié)腸中這些Wnt拮抗劑的水平上調(diào)DSS治療的天數(shù)（圖5C和補充圖11E）。在人UC樣品中觀察到DKK1和AXIN1減少（補充圖11F）。體外測定還顯示，在用MIR31抑制劑治療時，這些假定的靶基因的表達上調(diào)（圖5D）。3’UTR-熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，MIR31模擬物顯著抑制了WT Axin1，Gsk3b和Dkk1 3?UTR活性，但對MIR31結(jié)合位點發(fā)生突變的報告基因沒有明顯影響（圖5E和補充圖9B）。總之，MIR31可以通過以下途徑激活WNT信號通路。

四、基于MIR31的OKGM-PS微球遞送足以緩解DSS誘導(dǎo)的炎癥

   為了確定在結(jié)腸炎中用納米粒子靶向MIR31的可行性，我們設(shè)計了一種基于蛋白質(zhì)的封裝微球作為MIR31模擬傳遞系統(tǒng)（圖6A）。在該系統(tǒng)中，α-乳酸白蛋白（a-La）在Glu和Asp位點被部分水解以生成兩親性肽，可以自組裝成具有許多帶負(fù)電荷羧基的約20 nm肽體（PSs）22（圖6B和C）。為了通過靜電吸附連接MIR31模擬物，我們使用馬來酰亞胺（Mal）反轉(zhuǎn)PS表面的Zeta電位（圖6C）。PStMal的大?。ㄖ睆剑┖蚙eta電位隨時間穩(wěn)定（圖6D–F）。然后使用Mal將MIR31模擬物加載到a-La PS上（圖6G）。載有MIR31的模擬PS（PS-MIR31）納米顆粒具有低細(xì)胞毒性（圖6H），并且能夠?qū)IR31傳遞到細(xì)胞中（圖6I）。為避免腸道中基于肽的納米顆?？焖俳到?，我們將它們封裝在微球中，該微球是通過將羧基豐富的TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖（OKGM）與Fe3 +OKGM-PS-MIR31）交聯(lián)而形成的（圖6J）。 OKGM-PS-MIR31微球的尺寸范圍為10到50毫米（圖6J）。然后通過灌腸施用OKGM-PS-MIR31微球以檢查其體內(nèi)治療效果。OKGM-PS-MIR31可以將PS-MIR31釋放到結(jié)腸上皮細(xì)胞（圖6K），導(dǎo)致MIR31增加。

   OKGM-PS-MIR31微球可以顯著拯救MIR31 /小鼠的DSS結(jié)腸炎相關(guān)表型。該文獻測試OKGM-PS-MIR31微球?qū)T小鼠中DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的預(yù)防作用。OKGM-PS-MIR31微球減輕了炎癥，并減輕了結(jié)腸上皮的完整性，這通過增加體重，減少免疫反應(yīng)，延長結(jié)腸長度和增加上皮細(xì)胞增殖來表明（圖7A–G）。與之前的發(fā)現(xiàn)一致，OKNT-PS MIR31處理的小鼠結(jié)腸中的WNT和Hippo信號通路發(fā)生了改變（圖7G和補充圖16A和B），而MIR31靶基因減少了（圖7H和補充圖16C）。