新發(fā)現(xiàn)-納米微球治療結腸炎

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2020-03-31
炎癥性腸?。↖BD)是一類發(fā)病機制尚不清楚的慢性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病......

   炎癥性腸?。↖BD)是一類發(fā)病機制尚不清楚的慢性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。其臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和粘液膿血便等癥狀。近年來其發(fā)病率在我國快速增長,2015年時我國患病人數(shù)已達到35萬,近十年患者人數(shù)增長24倍。由于缺乏有效的治療藥物,IBD是不可治愈的疾病。隨著病情的發(fā)展可以引起腸道致殘性改變,包括腸穿孔、腸梗阻和腸癌等,嚴重影響病人生活質(zhì)量。
   在炎癥反應過程中,腸黏膜屏障破壞,病原微生物進入固有層,激活固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)而誘發(fā)炎癥反應,這種炎癥反應又會進一步破壞腸上皮的組織結構,進而導致更多的病原菌進入固有層,加劇炎癥反應。目前,關于潰瘍性結腸炎的研究主要集中在免疫細胞過度激活的調(diào)控機制上。然而,腸道上皮在炎癥反應中的功能和作用長期被人們忽視。
   2019年2月16日,《Gastroenterology》(IF=20.773)雜志發(fā)表“MicroRNA-31 Reduces Inflammatory Signaling and Promotes Regeneration in Colon Epithelium, and Delivery of Mimics in Microspheres Reduces Colitis in Mice”文章,此報道首次發(fā)現(xiàn)了炎癥信號在結腸炎中可以激活腸上皮細胞的“自我修復”機制,即受炎癥信號誘導的一種短核苷酸片段microRNA—miR-31負反饋地抑制上皮細胞炎癥反應同時促進上皮再生;并建立了一種適合直腸給藥的miR-31納米-微球體藥物,非常顯著地預防和治療了結腸炎。

   此研究路線圖-促炎癥因子受體IL-17R和受體結合蛋白Gp130負反饋抑制炎癥反應,并通過激活WNT和抑制Hippo信號通路促進腸上皮再生過程。miR-31模擬物納米-微球體藥物可以顯著促進在炎癥反應中損傷上皮的修復過程。
一、MIR31在IBD發(fā)炎的黏膜中表達增加,并受STAT3和NF-kB信號通路的調(diào)節(jié)

   結腸炎(IBD)包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩疾病(CD);葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠實驗性結腸炎;炎癥性腸粘膜中MIR31表達水平與UC患者C反應蛋白,紅細胞沉降率,Mayo評分和UC內(nèi)鏡嚴重程度指數(shù)以及C反應蛋白,紅細胞值呈正相關。CD患者中C反應蛋白,紅細胞沉降率,CD活性指數(shù)和CD的簡單內(nèi)鏡評分值分別與MIR31表達水平呈正相關(圖1C和D)。DSS治療后發(fā)炎的結腸中MIR31的急劇上調(diào)(圖1E和F)。在經(jīng)過5天的脈沖后停藥2天后,MIR31表達迅速下降,恢復到治療前的基線(圖1E)。綜上所述,MIR31主要在結腸上皮細胞中表達。在白細胞和基質(zhì)細胞中也觀察到了DSS誘導的MIR31表達上調(diào)(補充圖1B)。MIR31的啟動子中鑒定了1個STAT3和2個NF-kB結合位點(補充圖1C)。

二、MIR31的丟失會加劇炎癥反應并延遲上皮再生

   MIR31缺失對結腸的影響.補充圖結果:通過同時使用MIR31種系敲除(KO)和Villin Cre驅(qū)動的結腸上皮條件性KO(cKO)小鼠(補充圖2A)。與對照組相比,MIR31 KO和cKO小鼠的結腸長度沒有明顯改變(補充圖2B)。隱窩細胞增殖,尖端細胞凋亡,或野生型(WT)和KO小鼠之間的杯狀細胞數(shù)(補充圖2C–I)在飲用水中施用DSS,可減輕WT和MIR31 KO小鼠的結腸炎。給予DSS 5天,然后恢復3天。 DSS治療4天后,MIR31 /小鼠的體重減輕比野生型小鼠明顯多,并且在治療終止時體重沒有恢復(圖2A)。與對照相比,存活率降低(圖2B),較短的結腸長度(圖2C和D),較大的脾臟(圖2C和D)和較高的臨床疾病評分(圖2E)。時程分析顯示嚴重發(fā)炎在MIR31 /小鼠中對DSS治療的運動反應和DSS去除后再生反應受損。

   DSS治療后MIR31 /小鼠中增強的免疫反應。我們發(fā)現(xiàn)增加DSS治療的MIR31 /小鼠中白細胞和巨噬細胞的數(shù)量(圖3A和B),促炎細胞因子和炎癥小體成分的水平增加以及炎性抑制劑IL10的水平降低(圖3C–G)。促炎NF-kB和STAT3信號通路在MIR31 /小鼠中被過度激活(圖3H和I)。綜上所述,MIR31的丟失導致免疫反應亢進進行DSS治療。

三、MIR31直接抑制Il6st(編碼GP130),Il7r,和Il17ra在結腸上皮細胞內(nèi)

   RNA和DSS處理后,MIR31 /小鼠結腸中Il6st,Il7r和Il17ra的蛋白質(zhì)水平顯著升高(圖4A和B)。DSS治療5天后,MIR31 /結腸中GP130 GP,IL7Rt和IL17RAt細胞的數(shù)量顯著增加(圖4C–F)。體外分析顯示,MIR31模擬物抑制了Il6st,Il7r和Il17ra的表達,而MIR31抑制劑則促進了它們的上調(diào)(圖4G),表明這些推定的靶基因受MIR31以細胞自主方式調(diào)節(jié)。 3’端UTR-熒光素酶波特試驗顯示,MIR31模擬物顯著抑制了WT Il6st,Il7r和Il17ra 3?UTR活性,但對MIR31結合位點發(fā)生突變的報告基因沒有明顯影響(圖4H和補充圖9B)。在DSS處理過程中,Il6st,Il7r和Il17ra的表達下降(圖4I和J),與MIR31水平成反比。這些MIR31靶基因的上調(diào)在cKO結腸中得到進一步證實(圖4K和L)。在人UC組織中GP130表達降低(圖4M)??傊?, Il6st,Il7r和Il17ra的轉錄本是MIR31的直接靶點,并且它們的調(diào)節(jié)可能會影響MIR31在抑制腸粘膜免疫反應中的作用。

   WT小鼠的結腸上皮均激活了報告基因活性,而在MIR31中其報告活性明顯降低/結腸(圖5A和補充圖11A)。,DSS后RNA和蛋白質(zhì)水平在MIR31 /小鼠結腸中均顯著降低了Ctnnb1(編碼b-catenin)和WNT靶基因Ccnd1(編碼cyclin D1)和Axin2的表達水平治療(圖5B和補充圖11B)。在5個月后MIR31 /小鼠結腸中這些Wnt拮抗劑的水平上調(diào)DSS治療的天數(shù)(圖5C和補充圖11E)。在人UC樣品中觀察到DKK1和AXIN1減少(補充圖11F)。體外測定還顯示,在用MIR31抑制劑治療時,這些假定的靶基因的表達上調(diào)(圖5D)。3’UTR-熒光素酶報告基因檢測結果表明,MIR31模擬物顯著抑制了WT Axin1,Gsk3b和Dkk1 3?UTR活性,但對MIR31結合位點發(fā)生突變的報告基因沒有明顯影響(圖5E和補充圖9B)??傊琈IR31可以通過以下途徑激活WNT信號通路。

四、基于MIR31的OKGM-PS微球遞送足以緩解DSS誘導的炎癥

   為了確定在結腸炎中用納米粒子靶向MIR31的可行性,我們設計了一種基于蛋白質(zhì)的封裝微球作為MIR31模擬傳遞系統(tǒng)(圖6A)。在該系統(tǒng)中,α-乳酸白蛋白(a-La)在Glu和Asp位點被部分水解以生成兩親性肽,可以自組裝成具有許多帶負電荷羧基的約20 nm肽體(PSs)22(圖6B和C)。為了通過靜電吸附連接MIR31模擬物,我們使用馬來酰亞胺(Mal)反轉PS表面的Zeta電位(圖6C)。PStMal的大?。ㄖ睆剑┖蚙eta電位隨時間穩(wěn)定(圖6D–F)。然后使用Mal將MIR31模擬物加載到a-La PS上(圖6G)。載有MIR31的模擬PS(PS-MIR31)納米顆粒具有低細胞毒性(圖6H),并且能夠?qū)IR31傳遞到細胞中(圖6I)。為避免腸道中基于肽的納米顆粒快速降解,我們將它們封裝在微球中,該微球是通過將羧基豐富的TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖(OKGM)與Fe3 +OKGM-PS-MIR31)交聯(lián)而形成的(圖6J)。 OKGM-PS-MIR31微球的尺寸范圍為10到50毫米(圖6J)。然后通過灌腸施用OKGM-PS-MIR31微球以檢查其體內(nèi)治療效果。OKGM-PS-MIR31可以將PS-MIR31釋放到結腸上皮細胞(圖6K),導致MIR31增加。

   OKGM-PS-MIR31微球可以顯著拯救MIR31 /小鼠的DSS結腸炎相關表型。該文獻測試OKGM-PS-MIR31微球?qū)T小鼠中DSS誘導的結腸炎的預防作用。OKGM-PS-MIR31微球減輕了炎癥,并減輕了結腸上皮的完整性,這通過增加體重,減少免疫反應,延長結腸長度和增加上皮細胞增殖來表明(圖7A–G)。與之前的發(fā)現(xiàn)一致,OKNT-PS MIR31處理的小鼠結腸中的WNT和Hippo信號通路發(fā)生了改變(圖7G和補充圖16A和B),而MIR31靶基因減少了(圖7H和補充圖16C)。