LncRNA LINRIS-結(jié)直腸癌的預(yù)后生物標(biāo)志物

   結(jié)腸癌（CRC）是一種侵襲性的原發(fā)性腸惡性腫瘤，在全球所有類型的癌癥中，其發(fā)病率均排在第三位，而其死亡率則位居第二。 因此，尋找新的CRC治療策略具有重要意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在癌細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控中起著不可忽略的作用。小編為大家?guī)碜钚掳l(fā)表于Molecular Cancer上的文章：“LncRNA LINRIS stabilizes IGF2BP2 and promotes the aerobic glycolysis in colorectal cancer”。這項(xiàng)研究旨在確定一種特定的lncRNA，該基因可促進(jìn)結(jié)直腸癌（CRC）的進(jìn)展，并可能成為潛在的治療靶標(biāo)。我們在人類CRC樣本中篩選了高表達(dá)的lncRNA，并將其與匹配的鄰近正常組織進(jìn)行比較。RNA下拉和RNA免疫沉淀（RIP）分析證實(shí)了與LINRIS相互作用的蛋白質(zhì)。在體外和體內(nèi)測試了被LINRIS抑制的CRC細(xì)胞的增殖和代謝改變。

結(jié)果：
1.LINRIS在CRC中高表達(dá)，預(yù)后差
   為了探索可能影響CRC進(jìn)展的lincRNAs，我們將CRC期患者的腫瘤組織與配對的鄰近正常組織進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組比較。基于RNA-seq分析，我篩選出7個高表達(dá)lncRNA，包括LINC00920（更名為LINRIS）（圖1a）。我們發(fā)現(xiàn)LINRIS的高表達(dá)與CRC患者的不良總生存相關(guān)（圖1b，c）。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫，與正常細(xì)胞中的表達(dá)相比，大多數(shù)類型的腫瘤和CRC細(xì)胞系中LINRIS的表達(dá)上調(diào)（圖1d和圖1e），這些結(jié)果表明LINRIS通常起致癌基因的作用。食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC），胃癌（GC）和胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）的患者樣本中也顯示了LINRIS在消化道癌癥中的致癌狀態(tài)（圖1f）。接下來，我們用shRNA敲除CRC細(xì)胞中的LINRIS。 使用BrdU和3D培養(yǎng)法比較了用LINRIS特異性shRNA（sh-1和sh-2）轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞與陰性對照（sh-NC），結(jié)果確定了LINRIS的促癌作用（圖1g-i）。 通過RNA FISH分析，我們發(fā)現(xiàn)LINRIS主要位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1j-l）。

2.LINRIS與IGF2BP2相互作用并維持其表達(dá)
   為了確定LINRIS誘導(dǎo)CRC細(xì)胞進(jìn)程的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了RNA下拉測定和質(zhì)譜分析，以探索可能與LINRIS相關(guān)的蛋白質(zhì)。我們確定IGF2BP2作為我們的第一個靶標(biāo)。如圖2a-d所示，LINRIS可以直接結(jié)合到IGF2BP2。為了定位靶向IGF2BP2的LINRIS的結(jié)合位點(diǎn)，我們首先構(gòu)建了兩個截短的LINRIS載體并進(jìn)行了RNA下拉測定，因?yàn)樵搇ncRNA的長度僅為913 bp。但是，LINRIS的N端（1–570 nt）和C端（571–913 nt）片段都不能與IGF2BP2緊密結(jié)合（圖2e）。因此，根據(jù)其二級結(jié)構(gòu)，我們構(gòu)建了另一個帶有LINRIS 450-640 nt片段的載體。 RNA下拉分析表明該中間區(qū)域（450-640 nt）負(fù)責(zé)LINRIS和IGF2BP2之間的結(jié)合。
   通過測量LINRIS和IGF2BP2在人CRC細(xì)胞系中的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)它們之間呈正相關(guān)（圖2f，g）。 HCT116和DLD-1細(xì)胞中的LINRIS敲低均顯著下調(diào)了IGF2BP2的表達(dá)（圖2h）。 此外，敲除LINRIS會顯著增加IGF2BP2的泛素化，但會抑制IGF2BP2調(diào)節(jié)的mRNA（圖2i）。 因此，我們認(rèn)為IGF2BP2可能是LINRIS分子機(jī)制的關(guān)鍵，并且該lncRNA可能阻止了IGF2BP2的降解。

3.LINRIS保護(hù)IGF2BP2不被自噬降解
   IGF2BP2由2個RNA識別基序（RRM）和4 K同源性（KH）域組成，我們建立了3個帶有FLAG標(biāo)簽的載體，其中包含IGF2BP2的片段在非活性區(qū)彼此重疊（圖3a）。 RIP分析表明LINRIS主要結(jié)合到RRM區(qū)域（圖3b）。 然后，我們從CPLM數(shù)據(jù)庫中獲得了實(shí)驗(yàn)確定的IGF2BP2泛素化位點(diǎn)。 如圖3c所示，與野生型（WT）相比，代替K77R的K139R泛素突變顯著損害了IGF2BP2的泛素化。 此外，該突變還消除了RNA下拉測定法中LINRIS和IGF2BP2之間的結(jié)合（圖3d），表明LINRIS通過掩蓋K139抑制了IGF2BP2的泛素化。
   為了闡明IGF2BP的降解模式，用蛋白合成抑制劑CHX處理LINRIS表達(dá)下調(diào)的CRC細(xì)胞，其IGF2BP2半衰期比未處理的對照細(xì)胞要短（圖3e）。然而，在sh-LINRIS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，當(dāng)用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞時，內(nèi)源性IGF2BP2表達(dá)不會增加（圖3f），這表明IGF2BP2的降解可能與比泛素-蛋白酶體途徑更復(fù)雜的機(jī)制有關(guān)。
   除了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UBS），細(xì)胞蛋白在泛素化后可從自噬-溶酶體途徑（ALP）降解（圖3g）。如圖3h所示，內(nèi)吞IGF2BP2蛋白的減少被自噬抑制劑bafilomycin A1（Baf A1），NH4Cl和3-甲基腺嘌呤（3-MA）成功逆轉(zhuǎn)。相反，自噬激活劑Earle的平衡鹽溶液（EBSS）和雷帕霉素（Rap）降低了IGF2BP2的水平（圖3i）。 EBSS處理的細(xì)胞還表現(xiàn)出IGF2BP2和LC3B的共定位增加（圖3j）。綜上所述，提示LINRIS介導(dǎo)的IGF2BP2降解是通過泛素化自噬途徑實(shí)現(xiàn)的。

4.LINRIS與IGF2BP2相互作用影響MYC介導(dǎo)的糖酵解
   由于MYC的mRNA被IGF2BP2識別為其眾所周知的下游靶點(diǎn)，我們研究了LINRIS與IGF2BP2相互作用時糖酵解的變化。如圖4a、b所示，LINRIS被敲除后，其介導(dǎo)糖酵解的下游基因GLUT-1、PKM2、LDHA也表現(xiàn)出與MYC一致的水平下降。此外，MYC、GLUT-1、PKM2和LDHA的mRNA水平與CRC組織中的LINRIS水平呈正相關(guān)（圖4c）。如圖4d和e所示，沉默LINRIS可導(dǎo)致HCT116和DLD-1細(xì)胞糖酵解的減弱。圖4f顯示LINRIS基因敲除降低了一些典型的糖酵解產(chǎn)物。綜上所述，LINRIS對于維持癌細(xì)胞的糖酵解是必要的，糖酵解可能影響CRC的增殖。此外，我們用過表達(dá)IGF2BP2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了CRC細(xì)胞。 如圖4g-i所示，在HCT116和DLD-1細(xì)胞中，在某種程度上挽救了由LINRIS敲除誘導(dǎo)的增殖和糖酵解受損。

5.LINRIS的抑制抑制了體內(nèi)CRC的生長
   為了研究低LINRIS表達(dá)是否會抑制體內(nèi)CRC腫瘤的生長，我們向BALB/c裸鼠的盲腸注射了具有或不具有LINRIS敲低的HCT116細(xì)胞（sh-NC，sh-1和sh-2）。 與具有sh-1或sh-2的細(xì)胞相比，HCT116/sh-NC細(xì)胞在4周內(nèi)形成了更大，更重的原位腫瘤（圖5a和b）。此外，我們用異種移植（PDX）模型測試了抗LINRIS治療的體內(nèi)作用。如圖5c，d所示，通過RNAi抑制LINRIS可顯著抑制腫瘤的生長。切除的腫瘤切片的IHC染色顯示，隨著LINRIS的耗竭，與IGF2BP2和MYC一致的Ki-67表達(dá)降低（圖5e和f）?？傮w而言，阻塞LINRIS-IGF2BP2-MYC軸是有希望的CRC治療方法。

6.GATA3抑制LINRIS的轉(zhuǎn)錄活性
   為了研究調(diào)控LINRIS轉(zhuǎn)錄的因素，我們使用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測了潛在的轉(zhuǎn)錄因子，并發(fā)現(xiàn)GATA3具有與LINRIS啟動子結(jié)合的最大可能性（圖6a）。使用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析了來自多個實(shí)驗(yàn)的CRC微陣列數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)表明GATA3在CRC組織中的表達(dá)水平低于正常組織（圖6b）。此外，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫，更高的GATA3表達(dá)與CRC患者的更好預(yù)后相關(guān)（圖6c）。抑制GATA3成功地解放了LINRIS的轉(zhuǎn)錄（圖6d）。 ChIP-PCR分析顯示LINRIS啟動子區(qū)域被GATA3占據(jù)（圖6e），熒光素酶啟動子分析顯示GATA3過表達(dá)抑制LINRIS活性，反之亦然（圖6f，g）。此外，LINRIS啟動子中GATA3結(jié)合位點(diǎn)的突變消除了這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖6h）。通過分析中山大學(xué)癌癥中心的人類CRC樣本中LINRIS和GATA3的mRNA表達(dá)，我們還觀察到它們之間呈負(fù)相關(guān)（圖6i）。我們還通過RNA ISH分析測量了LINRIS的表達(dá)，并通過IHC分析測量了GATA3的表達(dá)（圖6j）。如圖6k所示，增加的LINRIS表達(dá)更可能伴隨著GATA3表達(dá)的降低，反之亦然?？傊珿ATA3抑制了LINRIS的轉(zhuǎn)錄。

7.LINRIS-IGF2BP2-MYC軸與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)
   為了進(jìn)一步說明LINRIS-IGF2BP2-MYC軸在CRC發(fā)育中的臨床和病理學(xué)意義，我們分析LINRIS、Ki-67，IGF2BP2，MYC，GLUT-1，PKM2和LDHA的表達(dá)（圖7a）。如圖7b所示，高LINRIS組與Ki-67，IGF2BP2，MYC，GLUT-1，PKM2和LDHA的高表達(dá)相一致，而低LINRIS組表現(xiàn)出相反的結(jié)果。此外，與正常組織相比，這些患者的腫瘤組織中的IGF2BP2表達(dá)明顯更高（圖7c，d）。 IGF2BP2的較高表達(dá)也與CRC患者的預(yù)后不良有關(guān)（圖7e）。高LINRIS / IGF2BP2組的預(yù)后較其他兩組差（圖7f）。綜上所述，LINRIS-IGF2BP2-MYC軸深刻影響了CRC的發(fā)展和預(yù)后，并成為潛在的治療靶點(diǎn)。

結(jié)論：
   我們在CRC中發(fā)現(xiàn)了一種名為LINRIS的高表達(dá)lncRNA。LINRIS通過泛素化-自噬途徑阻斷IGF2BP2的降解。因此，MYC介導(dǎo)的糖酵解被下調(diào)，抑制了體內(nèi)外CRC細(xì)胞的增殖。LINRIS-IGF2BP2-MYC軸促進(jìn)CRC的進(jìn)展。LINRIS是一種獨(dú)立的CRC預(yù)后生物標(biāo)志物。