lncRNA LCAT1通過海綿吸附miR-4715-5p調(diào)節(jié)RAC1的表達促進肺癌進展

   lncRNA逐漸成為癌癥發(fā)展和進程中的關鍵角色。 然而，大多數(shù)lncRNA在肺癌發(fā)生中的生物學作用和臨床意義仍不清楚。在這項研究中，作者確定并探索了新的lncRNA，即肺癌相關轉(zhuǎn)錄本1（LCAT1）在肺癌中的促進作用。本文于2019年11月發(fā)表在Molecular Cancer（IF：10.679）雜志上。
主要結(jié)果如下：
1、LCAT1在肺癌中上調(diào)，與預后不良有關
   如圖1所示，lncRNA LCAT1在在正常組織中低表達，在肺癌中高表達，并與肺癌不良預后相關。

2、LCAT1沉默抑制肺癌細胞的體內(nèi)外增殖
   如圖2所示，沉默LCAT1表達后，肺癌細胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力都下降了。

3、LCAT1敲除可降低肺癌細胞的轉(zhuǎn)移，并誘導細胞G1期阻滯
   如a-e所示，敲除LCAT1后，肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和遷移能力明顯下降。圖3f所示，轉(zhuǎn)染LCAT1特異性干擾片段后，細胞的G1期受到抑制。為了探究LCAT1涉及到的分子和通路，敲低LCAT1后進行了轉(zhuǎn)錄組測序，圖3g是差異表達基因熱圖，主要的靶向途徑包括細胞周期和粘附連接（圖3h）。

4、LCAT1在肺癌細胞中起ceRNA作用海綿吸附miR-4715-5p
   亞細胞定位顯示LCAT1主要定位于細胞質(zhì)(圖4a和b)。RIP實驗顯示，LCAT1與Ago2結(jié)合，Ago2是RNA誘導沉默復合物的主要成分，參與miRNA介導mRNA抑制(圖4c)。這提示，LCAT1可能作為ceRNA作用于miRNA發(fā)揮功能。為了驗證這個猜測，首先預測LCAT1與miRNA之間的作用位點，如圖4d所示。預測的4種miRNA種，只有miR-330-5p和miR-4715-5p才能抑制LCAT1驅(qū)動的熒光素酶活性，而miR-4715-5p的抑制作用強于miR-330-5p(圖4 e)。進一步的驗證LCAT1與miR-4715-5p的作用關系(圖4 f)，如圖4g 所示，敲除LCAT1顯著增加了miR-4715-5p的表達。

5、LCAT1的功能部分是通過抑制miR-4715-5p表達介導的
   如圖5a-d所示，過表達miR-4715-5p可以顯著降低肺癌細胞的增殖，遷移，侵襲和集落形成。過表達miR-4715-5p可在Calu1、A549和HOP62細胞系中誘導G1-G0期的細胞周期阻滯(圖5e-h)。為了研究miR-4715-5p是否介導LCAT1在肺癌細胞中的功能，將si- LCAT1與miR-4715-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染至肺癌細胞，結(jié)果顯示miR-4715-5p抑制劑可以部分挽救si- LCAT1介導的細胞增殖抑制（圖5i-j）。

6、RAC1是miR-4715-5p的靶基因，由LCAT1間接調(diào)控
   靶基因預測并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，RAC1是敲除LCAT1后變化最顯著的靶基因之一，并且屬于Ras信號通路（圖6a）。突變RAC1與miR-4715-5p的結(jié)合位點之后，熒光素酶信號顯著下降（圖6b）。過表達miR-4715-5p的細胞中RAC1 mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)（圖6 c和d）。由于LCAT1可以海綿吸附miR-4715-5p，因此接下來驗證LCAT1是否通過與miR-4715-5p的競爭性結(jié)合影響RAC1的表達。結(jié)果顯示，LCAT1下調(diào)顯著降低了Calu1和A549細胞中RAC1 mRNA和蛋白水平 (圖6e和f)。TCGA數(shù)據(jù)顯示，RAC1在肺癌組織中顯著上調(diào)(圖6g)，并且RAC1高表達與肺癌患者預后不良顯著相關(圖6h和i)。此外肺癌患者RAC1拷貝數(shù)正?；虻蜁r往往具有較高的LCAT1表達，從而可能會驅(qū)動RAC1的表達(圖6j)。

7、LCAT1通過海綿吸附miR-4715-5p調(diào)控RAC1 / PAK1的表達促進肺癌細胞增殖和進展
   敲低RAC1后細胞的集落形成和增殖均顯著下降（圖7a和b），同時誘導G1-G0期細胞阻滯（圖7c和d）。此外，WB實驗發(fā)現(xiàn)抑制RAC1限制抑制了PAK1蛋白磷酸化（圖7e）。類似的，在miR-4715-5p過表達和LCAT1敲低的肺癌細胞中， PAK1的磷酸化和表達水平均下調(diào)(圖7f和g)。

8、RAC1抑制劑與紫杉醇聯(lián)合治療肺癌
   基于以上結(jié)果，作者推測是否可以通過藥物抑制RAC1活性來達到治療肺癌的結(jié)果。EHop-016是一種新型的RAC GTPase小分子抑制劑，圖8a所示，EHop-016能抑制肺癌細胞增殖，且其在三種細胞系中的用量有所不同（圖8b）。因此作者檢測了EHop-016對RAC1活性的影響，結(jié)果顯示，EHop-016可降低RAC1-GTP的表達(圖8c)，而LCAT1敲除則使細胞對EHop-016失去敏感性(圖8 d)。紫杉醇是一種廣泛用于治療包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的化療藥物。因此作者探究了其體外聯(lián)合治療的效果。結(jié)果顯示，EHop-016與紫杉醇聯(lián)合治療可使細胞生長速度降低60-70%，對細胞活力的影響明顯增大(P < 0.05)。與EHop-016、紫杉醇單藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義（圖8f）。

   作者提出的機制路線圖如圖8g所示，lncRNA LCAT1通過海綿吸附miR-4715-5p，從而調(diào)控RAC1 / PAK1的表達，最終促進肺癌細胞增殖和進展。
參考文獻：
   Yang Juze., Qiu Qiongzi., Qian Xinyi., Yi Jiani., Jiao Yiling., Yu Mengqian., Li Xufan., Li Jia., Mi Chunyi., Zhang Jisong., Lu Bingjian., Chen Enguo., Liu Pengyuan., Lu Yan., (2019). Long noncoding RNA LCAT1 functions as a ceRNA to regulate RAC1 function by sponging miR-4715-5p in lung cancer., Mol. Cancer, 18, 171.