突破研究局限-----血漿胞外小泡microRNAs檢測(cè)肺癌

導(dǎo)語(yǔ)：
   肺癌具有潛在的惡性和異質(zhì)性特點(diǎn)，尤其難以診斷, 因此，需要開(kāi)發(fā)無(wú)創(chuàng)的肺部毛玻璃樣結(jié)節(jié)GGNs診斷方法和風(fēng)險(xiǎn)層理方法。血漿胞外囊泡(EVs)來(lái)源的miRNA對(duì)孤立性肺結(jié)節(jié)(SPNs)，尤其對(duì)毛玻璃結(jié)節(jié)(GGNs)的臨床診斷和分子特征提供了可行性思路。然而，回顧性研究固有的選擇性偏見(jiàn)和不太嚴(yán)格的識(shí)別方法對(duì)研究有存有一些局限性。 因此，有待對(duì)照研究比較惡性孤立性肺結(jié)節(jié)(SPNs)與良性疾病之間的差異。
技術(shù)路線(xiàn)：
1.收集病人血漿樣本，并分離血清
2.分離血漿EV，納米顆粒跟蹤分析(NTA)EVs的數(shù)目大小，EVs表征等
3.掃描電鏡(SEM)掃描電鏡分析，然后從血漿EVs中分離RNA。
4.小RNA文庫(kù)的制備和測(cè)序
5.miRNA-seq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。
6.EVs miRNA在三個(gè)惡性結(jié)節(jié)亞群中的表達(dá)特點(diǎn)
7.惡性結(jié)節(jié)分層的生物學(xué)分析。
8.術(shù)前和術(shù)后血漿樣本miRNA譜的比較
研究結(jié)果：
1.患者及臨床病理資料
   共納入99例患者，其中良性結(jié)節(jié)20例(20.2%)。其他樣本被診斷為腺癌，范圍從原位腺癌(AIS)到侵襲性腺癌。79例惡性腫瘤標(biāo)本中16例為pGGNs, 21例為mGGNs, 42例為實(shí)性結(jié)節(jié)，其中20例為術(shù)后血漿標(biāo)本。

2.Evs表征
   使用Western blotting評(píng)估了7個(gè)代表性EV樣本中的幾個(gè)囊泡標(biāo)記，包括Alix、TSG101、Syntenin、CD9和Calnexin。此外，為了表征等離子體中電動(dòng)汽車(chē)的濃度和尺寸，使用了Nanosight NS300系統(tǒng)進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析。結(jié)果表明，分離出的囊泡大部分在100 nm左右，這是典型的外泌體大小。另外，兩個(gè)典型EV樣品的SEM圖像如下圖所示。

3.歸一化、穩(wěn)定化和組合來(lái)構(gòu)造SVM分類(lèi)器
   使用映射率大于90%的樣本，設(shè)置了5個(gè)映射和表達(dá)的讀取作為截止點(diǎn)。將其作為兩個(gè)miRNAs的比值進(jìn)行分析，其中一個(gè)miRNA被認(rèn)為是靶基因，其他miRNA被認(rèn)為是參考基因。使用兩對(duì)miRNA的比值來(lái)構(gòu)建一個(gè)二維空間，SVM可以用來(lái)確定區(qū)分良惡性結(jié)節(jié)的最佳cut-off。miR - 185 - 5 - p / miR-32-5p和miR - 140 - 3 - p / let-7f-5p SVM模型顯示診斷價(jià)值最高,敏感性和特異性的85.1%和75%,分別在參照集和59.3%和100%,分別在驗(yàn)證集。此外, miRNA的結(jié)合靈敏度最高的miR-27a-5p / miR - 550 - 5 - p和miR - 1908 - 5 - p / miR - 98 - 5 - p。該組合在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的敏感性分別為100%和96.9%。此外，特異性最高的miRNA組合為miR-185-5p/miR-378i和miR-495-3p/miR-99b-3p。這種組合在參照集和驗(yàn)證集的特異性都是100%。

4. EVs miRNA在三個(gè)惡性結(jié)節(jié)亞群中的表達(dá)特點(diǎn)
   為了進(jìn)一步評(píng)估血液EVs miRNA表達(dá)譜的潛在分類(lèi)價(jià)值，術(shù)前對(duì)所有來(lái)自惡性結(jié)節(jié)患者的樣本進(jìn)行PCA分析。pGGN樣品與固體樣品的分布比較明顯。pGGN樣品主要集中在中心區(qū)域，而固體樣品分為兩組。有趣的是，表皮生長(zhǎng)因子受體基因19外顯子小缺失的12個(gè)實(shí)性結(jié)節(jié)中有11個(gè)被歸為1類(lèi);這明顯高于第二組。mGGN樣品也可以與固體樣品歸為同一類(lèi)。這些結(jié)果揭示了血液EVs miRNAs中惡性結(jié)節(jié)的復(fù)雜性。

5. 惡性結(jié)節(jié)分層的生物學(xué)分析
   選擇絕對(duì)權(quán)重大于0.05的1組和2組差異表達(dá)的miRNA。通路富集分析顯示，這些miRNA主要針對(duì)癌癥相關(guān)通路，如細(xì)胞周期和粘附連接。有趣的是，miR-500a-3p、miR-501- 3p和miR-502-3p三種不同的陽(yáng)性表達(dá)的miRNA對(duì)肺腺癌患者在腫瘤組織中的生存具有很強(qiáng)的危險(xiǎn)比。相反，負(fù)權(quán)數(shù)高的miRNA并沒(méi)有顯示出顯著的危險(xiǎn)比。miR-500a-3p、miR-501-3p和miR-502-3p位于CLCN5內(nèi)含子的近端，可能是協(xié)同調(diào)控的。與第二組相比，第一組這三種miRNA均上調(diào)，p值顯著(p < 0.001, p < 0.001, p < 0.001);。有趣的是，TCGA中這三種miRNAs在腫瘤組織中的上調(diào)與這些miRNAs下調(diào)后腫瘤組織中觀察到的更好的總體生存相關(guān)。總的來(lái)說(shuō)，1組實(shí)性結(jié)節(jié)血液EVs中這3種miRNA的上調(diào)與患者預(yù)后的改善有關(guān)。

 

6. 術(shù)前和術(shù)后血漿樣本miRNA譜的比較
   通過(guò)比較術(shù)前和術(shù)后血液EVs的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)9種miRNA在術(shù)前和術(shù)后有顯著的差異表達(dá)。在這些miRNA中，miR-320b和miR- 128-3p在1組和2組實(shí)性結(jié)節(jié)中也有差異表達(dá)。miR-320b在與細(xì)胞增殖相關(guān)的Hippo信號(hào)通路中富集。然而，miR-128-3p的靶點(diǎn)沒(méi)有富集通路。這些數(shù)據(jù)表明，1組和2組實(shí)性結(jié)節(jié)可能來(lái)自不同的致癌途徑。此外，miR-500a-3p、miR-501-3p、miR-502-3p在術(shù)后均有上調(diào)，其邊緣p值分別為(p = 0.058、p = 0.011、p = 0.020)，提示miR-500a-3p、miR-501-3p、miR-502-3p的常表達(dá)可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。

總結(jié)： 
   評(píng)估了血漿胞外囊泡(EVs)來(lái)源的miRNA對(duì)孤立性肺結(jié)節(jié)(SPNs)，尤其是毛玻璃結(jié)節(jié)(GGNs)的診斷價(jià)值和分子特征。對(duì)59例患者(包括12例良性結(jié)節(jié)患者)的血漿EVs miRNA進(jìn)行小RNA測(cè)序(2017，參照集)。對(duì)另外40個(gè)個(gè)體的MiRNA譜進(jìn)行了測(cè)序(2018年，驗(yàn)證集)。總的來(lái)說(shuō)，包括16例單純ggn、21例混合ggn和42例實(shí)性結(jié)節(jié)，20例患者術(shù)后可獲得配對(duì)的血漿樣本。利用靶miRNA/參考miRNA比值構(gòu)建支持向量機(jī)(SVM)模型。特異性最好的SVM模型在參照集和驗(yàn)證集的特異性分別為100%。靈敏度最好的模型在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的靈敏度分別為100%和96.9%。主成分分析顯示，純GGN分布與實(shí)性結(jié)節(jié)不同，混合GGN呈彌散分布。在差異表達(dá)的miRNA中，miR-500a-3p、miR-501-3p和miR-502-3p在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，總體生存期提高。SVM分類(lèi)器能準(zhǔn)確區(qū)分惡性ggn和良性結(jié)節(jié)。其獨(dú)特的輪廓特征為EVs miRNA作為肺癌預(yù)后因子的可行性提供了思路。
   總之，提供了一種穩(wěn)定且有價(jià)值的基于血漿EVsderived miRNAs的SVM分類(lèi)器模型，用于區(qū)分惡性GGNs和良性結(jié)節(jié)(最高特異性為100%;最高靈敏度:98.9%)。此外，還發(fā)現(xiàn)了純GGNs、混合GGNs和固體樣品中miRNA表達(dá)譜的明顯特征。我們認(rèn)為開(kāi)發(fā)一種有效的、無(wú)創(chuàng)的診斷和風(fēng)險(xiǎn)分層模型對(duì)臨床醫(yī)生有幫助。