載脂蛋白C3在炎癥中的新功能

   NLRP3-炎癥體驅(qū)動的炎癥與多種疾病的發(fā)病機制有關。內(nèi)源性炎癥因子激活劑的鑒定對于開發(fā)新的抗炎治療策略至關重要。德國薩爾蘭大學Thimoteus Speer研究組發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白C3通過替代激活炎性小體誘導炎癥和器官損傷。該研究2019年12月9日在線發(fā)表在國際學術期刊Nature Immunology：《自然—免疫學》，影響因子= 23.53的一篇論文“Apolipoprotein C3 induces inflammation and organ damage by alternative inflammasome activation”。該研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C3(Apo3)通過胱天蛋白酶-8和Toll樣受體2和4的二聚化誘導另一種NLRP3炎癥體，從而激活人單核細胞中的NLRP3炎癥體。為NLRP3炎癥體的調(diào)節(jié)和含有ApoC3的富含甘油三酯脂蛋白的病理生理學作用提供了新的見解。靶向ApoC3可以防止器官損傷，并為血管和腎臟疾病提供抗炎治療。

亮點：
（1）該研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C3(ApoC3)通過caspase-8和Toll樣受體2和4二聚化的方式誘導NLRP3炎性小體的替代激活，從而激活了人單核細胞中的NLRP3炎性小體。
（2）人單核細胞中炎性小體的替代激活受Toll樣受體蛋白SCIMP的調(diào)控。這種激活引起Lyn / Syk依賴的鈣離子進入和活性氧的產(chǎn)生，導致caspase-8的活化。
（3）在人源化的小鼠模型中，ApoC3在體內(nèi)以NLRP3和caspase-8依賴性方式激活人單核細胞從而阻止內(nèi)皮再生并促進腎臟損傷。
結(jié)果分析：
一、ApoC3誘導無菌炎癥
   低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)處理了人單核細胞，并確定了IL-1β的釋放。與HDL和LDL相反，VLDL刺激了IL-1β的釋放(圖1a)。脫脂的VLDL刺激的IL-1β釋放的程度與天然VLDL相似，表明VLDL的蛋白質(zhì)部分可能是其對IL-1β釋放的影響(圖1b)。蛋白質(zhì)組學分析檢測到ApoC3，ApoE和ApoC2是VLDL顆粒中三種最豐富的蛋白質(zhì)。用這些載脂蛋白孵育單核細胞后，發(fā)現(xiàn)只有ApoC3才能誘導IL-1β釋放(圖1c)。六個獨立分離的脂蛋白制劑的VLDL級分中檢測到大量的ApoC3(圖1d)。盡管HDL也包含ApoC3，但它本身并沒有誘導IL-1β釋放，甚至沒有降低ApoC3驅(qū)動的IL-1β釋放(圖1e)，這表明HDL及其主要成分ApoA1減少了炎性體的激活，這與之前的研究一致報告。 ApoC3與人單核細胞直接相互作用(圖1f)并誘導IL-1β的釋放，但也誘導非炎性體依賴性細胞因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF)的濃度依賴性方式(圖1g–i)。這表明ApoC3可能激活NLRP3炎性體以誘導IL-1β釋放。

                                                     圖1:Apo3誘導全身炎癥

二、ApoC3激活人類單核細胞中的另一種炎性體途徑
   ApoC3能夠誘導單核細胞釋放IL-1β，而無需使用先前報道為生理學相關濃度的TLR配體(圖2a)進行預刺激。直接從人血漿中分離的ApoC3誘導的IL-1β釋放的程度與整個研究中使用的來自商業(yè)供應商的ApoC3的釋放程度相似(圖2b)。正如預期的那樣，ApoC3處理誘導了IL-1β和caspase-1的成熟(圖2c)。因此，caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK廢除了ApoC3誘導的IL-1β釋放(圖2d)，表明ApoC3釋放IL-1β涉及caspase-1的激活。相反，ApoC3僅誘導小鼠骨髓源巨噬細胞(BMDM)中的IL-1β適度釋放，與人單核細胞相比降低了十倍(圖2e)。ApoC3不會誘導焦磷酸化細胞死亡(圖2f)或ASC斑點的形成(圖2g)。此外，ApoC3介導的IL-1β釋放不依賴于人類單核細胞中的鉀流出(圖2h)。因此，ApoC3不會誘導加德明D的裂解(圖2i)。已經(jīng)描述了人類單核細胞可以獨立于鉀外排和熱解而響應LPS參與其他的炎性體活化，這需要通過Toll / interleukin-1受體域的適配器誘導干擾素-β(TRIF)受體進行TLR依賴性信號傳導-相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(RIPK1)和胱天蛋白酶8。 ApoC3處理誘導了caspase-8的裂解(圖2j)，并且對caspase-8的催化抑制作用顯著降低了ApoC3驅(qū)動的IL-1β釋放(圖2k)。此外，通過特異性抑制劑抑制RIPK1和TRIF可以顯著降低響應ApoC3的單核細胞IL-1β釋放(圖2l)。這些發(fā)現(xiàn)表明，ApoC3代表人類單核細胞中替代性炎性體激活的新型誘導劑。

                                             圖2:Apo3誘導選擇性NLRP3炎癥體激活

三、ApoC3需要TLR2和TLR4異二聚體誘導誘導的炎性體激活
   NF-κB抑制劑Bay 11-7082完全廢除了ApoC3誘導的IL-1β產(chǎn)生(圖3a)。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和應激激活的蛋白激酶( SAPKs)/ c-Jun氨基末端激酶(JNK)(圖3b)。此外，ApoC3能夠引發(fā)人類單核細胞進行經(jīng)典的炎性體激活(圖3c)。 ApoC3與被Tlr2或Tlr4相似轉(zhuǎn)染的人類胚胎腎臟(HEK)細胞相互作用(圖3d，e)。因此，對TLR2或TLR4的抗體阻斷減少了人類單核細胞中ApoC3誘導的IL-1β產(chǎn)生(圖3f)?？贵w對TLR2或TLR4的阻斷降低了ApoC3與人類單核細胞的相互作用(圖3g)。為了測試是否需要ApoC3的內(nèi)在化來誘導IL-1β釋放，將ApoC3固定在細胞培養(yǎng)板上，然后將其接種在人單核細胞上(圖3h)。接下來，單獨或組合用TLR4配體LPS或TLR2配體Pam3CSK4刺激人類單核細胞，以評估每個TLR的個體貢獻(圖3i)。與單獨用LPS處理的細胞相比，用Pam3CSK4刺激LPS引發(fā)的細胞可導致更高的IL-1β產(chǎn)生和釋放以及caspase-1裂解(圖3j)。在未刺激的細胞中，CFP和YFP熒光主要定位在細胞質(zhì)中(圖3k)。這些發(fā)現(xiàn)表明，TLR2和TLR4的異二聚體是ApoC3誘導的炎性體激活的關鍵介質(zhì)。

                                              圖3:Apo3誘導TLR2和TLR4的異二聚化

四、炎性體的替代活化需要鈣依賴性超氧化物的產(chǎn)生
   鈣離子在ApoC3介導的IL-1β的產(chǎn)生中起著至關重要的作用(圖4a)。鈣螯合劑還阻止了LPS依賴性IL-1β的產(chǎn)生。因此，ApoC3誘導細胞鈣內(nèi)流(圖5c)。瞬時受體電位陽離子通道(TRPM2)抑制劑氟芬那酸，而不是儲庫操縱的鈣進入抑制劑BTP-2或磷脂酶C抑制劑U-73122，顯著降低ApoC3誘導的IL-1β釋放(圖4b)。通過電子自旋共振(ESR)光譜測量，ApoC3和LPS處理均顯著增加了超氧化物的產(chǎn)生(圖4c，d)。在鈣螯合劑存在下，ApoC3誘導的超氧化物產(chǎn)生減少(圖4e)。用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)，黃素蛋白抑制劑DPI或NADPH氧化酶抑制劑VAS-2870預處理單核細胞，幾乎完全消除了響應ApoC3和LPS的IL-1β釋放，同時阻斷了使用MitoTEMPO的線粒體ROS無效(圖4f)。該發(fā)現(xiàn)表明氧化應激觸發(fā)了交替的炎性體活化的信號級聯(lián)反應，從而導致IL-1β的產(chǎn)生。ApoC3增加了單核細胞中TXNIP的表達，這被BAPTA-AM和NAC廢除了(圖4i)。

                                        圖4:替代性炎癥體激活需要鈣依賴性超氧化物產(chǎn)生

五、可選的炎性體激活涉及銜接蛋白SCIMP
   為了探討LPS和ApoC3對TLR的激活如何轉(zhuǎn)化為替代的炎癥小體激活，集中研究了脾酪氨酸激酶(Syk)，它已被證明有助于NLRP3炎癥小體激活。ApoC3和LPS觸發(fā)了Syk的磷酸化(圖5a)。因此，抑制Syk可防止LPS和ApoC3誘導的IL-1β釋放(圖5b)。為了確定Syk是否代表上游信號誘導鈣流入和隨后的超氧化物產(chǎn)生，在Syk抑制劑R406存在的情況下測量了細胞鈣通量(圖5c)。Syk的抑制顯著降低了人類單核細胞中ApoC3介導的鈣內(nèi)流以及超氧化物的產(chǎn)生和TXNIP表達(圖5c-e)。用LPS或ApoC3刺激的人單核細胞中進行了交聯(lián)實驗，并觀察到另一個高分子量條帶，將其切下并進行了蛋白質(zhì)組學分析(圖5f)。值得注意的是，在用LPS或ApoC3刺激后，檢測到了跨膜蛋白SCIMP(圖5g)。因此，LPS或ApoC3增加了人單核細胞中SCIMP的表達(圖5h)。ApoC3迅速誘導了人類單核細胞中SCIMP，Lyn和Syk之間的相互作用(圖5i)。ROS清除鈣螯合和Syk抑制減少了LPS響應時前caspase-8的加工，表明SCIMP介導的Syk激活可能代表了caspase-8依賴性替代性炎性體激活的上游事件(圖5j– l)。

                                            圖5:替代性炎癥體激活涉及銜接蛋白SCIMP

六、ApoC3在體內(nèi)誘導人源化小鼠的器官損傷
   由于ApoC3激活的其他炎性體激活僅限于人類單核細胞，因此使用了人源化的小鼠模型。通過流式細胞術確定，ApoC3誘導了NOD-SCID小鼠移植人單核細胞中IL-1β的表達(圖6a)。 為了評估ApoC3對血管再生的作用，使用血管周圍頸動脈損傷模型(圖6b)。頸動脈損傷后三天，與用PBS處理的小鼠相比，在用人單核細胞重組并注射ApoC3的小鼠中，受損頸動脈的重新內(nèi)皮化顯著減少(圖6c，d)。在用特異性NLRP3抑制劑MCC950或caspase-8抑制劑Z-IETD-FMK治療的小鼠中，ApoC3對再內(nèi)皮化的抑制作用消失了(圖6e，f)。將用PKH67標記的人單核細胞重構的NOD-SCID小鼠進行單側(cè)輸尿管結(jié)扎，作為腎臟損傷的模型(圖6g)。重要的是，ApoC3強烈增強了腎臟的損害，如擴張的腎小管百分比增加所示(圖6h-i)。因此，在經(jīng)ApoC3處理的小鼠中，在受傷的腎臟中積聚的人類單核細胞數(shù)量明顯更高(圖6j，k)。這些發(fā)現(xiàn)表明，ApoC3介導的人類單核細胞活化導致體內(nèi)器官損傷增加。

                                          圖6:Apo3和人單核細胞在體內(nèi)誘導器官損傷

七、ApoC3與死亡率增加有關
   在急性心肌梗塞(AMI)和CKD患者中測量ApoC3血漿濃度，以強調(diào)實驗結(jié)果的相關性。與健康受試者相比，在患有AMI和CKD的患者中，ApoC3血漿濃度顯著更高(圖7a，b)。路德維希港風險與心血管健康(LURIC)研究的3,313名參與者進行了冠狀動脈造影，其中ApoC3血漿水平高的人具有明顯更高的全身炎癥標志物，例如E-選擇蛋白和高敏感性C反應蛋白(hsCRP)(圖7c，d)。為了研究中位9.9年隨訪期間ApoC3與全因死亡率之間的關聯(lián)，建立了危險比圖(圖7e)。值得注意的是，ApoC3血漿水平與更高的全因死亡率顯著相關。這突顯了ApoC3作為炎癥小體驅(qū)動的炎癥介質(zhì)的臨床意義。

                                                   圖7:Apo3與死亡率增加相關
結(jié)論：
   ApoC3是一種新型的介體，通過TLR2，TLR4和SCIMP的異源三聚化以及隨后的器官損傷，導致人類單核細胞中的炎性體替代激活。 這些發(fā)現(xiàn)不僅與ApoC3有關，而且擴展了對替代性炎癥小體激活所需的信號通路的認識。 該研究為NLRP3炎性小體的調(diào)控以及富含ApoC3的甘油三酯脂蛋白的生理病理作用提供了新的見解。靶向ApoC3可以防止器官損傷并為血管和腎臟疾病提供了新的抗炎治療策略。