神經(jīng)母細胞瘤的有效療法——靶向抑制circ-CUX1

   好氧糖酵解是腫瘤進展中代謝重編程的一個標志。然而，調節(jié)糖酵解基因表達的機制在兒童最常見的顱外惡性腫瘤神經(jīng)母細胞瘤（NB）中仍不清楚。從此研究背景出發(fā)，本文作者發(fā)現(xiàn)CUT-like homeobox 1 (CUX1) 和CUX1-generated circular (circ-CUX1)有助于有氧糖酵解和NB的進展。而阻斷circ-CUX1級聯(lián)可以有效抑制NB的體內(nèi)體外進展。本文于2019年12月新近發(fā)表在EMBO Mol Med (IF: 10.624)期刊上。
結果如下：
1、CUX1促進好氧糖酵解和腫瘤進展
   對88例NB患者的微陣列數(shù)據(jù)進行綜合分析獲得了8個差異表達的糖酵解基因，并發(fā)現(xiàn)了52個與NB臨床表現(xiàn)相關的轉錄因子，這52個轉錄因子與這8個糖酵解基因的轉錄因子存在重疊，其中CUX1是潛在靶點數(shù)量最多的轉錄因子（Fig 1A）。異位表達CUX1可以相應的增減或減少糖酵解相關基因的表達，如ENO1、GP1和PGK1，其他基因的表達則不受影響（Fig 1B-E）。過表達p110 CUX1增加了細胞的胞外酸化率(ECAR)，降低了細胞的耗氧率(OCR)，而CUX1敲低或E64D處理顯著減弱了糖酵解過程(圖1F和G)。以上結果說明CUX1是一種促進好氧糖酵解和腫瘤進展的轉錄因子。

2、Circ-CUX1在NB組織和細胞系中表達上調
   如圖2所示，circ-CUX1是由CUX1的外顯子2和部分內(nèi)含子2組成的393-nt環(huán)狀CUX1，定位于細胞核，并在NB和其細胞系中均高表達。此后，作者經(jīng)實驗證實circ-CUX1在轉錄水平上增強CUX1的表達。

3、Circ-CUX1在腫瘤進展中發(fā)揮致癌作用
   如圖3所示，過表達circ-CUX1促進了體外腫瘤細胞的集落形成、遷移和侵襲，促進體內(nèi)腫瘤的生長，肺部轉移以及腫瘤Ki-67和CD31表達、葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生、ATP水平。這些結果表明circ-CUX1在腫瘤的發(fā)生和侵襲性中發(fā)揮著致癌作用。

4、Circ-CUX1與NB細胞中的EWSR1蛋白直接相互作用
   圖4A是作者尋找circ-CUX1相互作用蛋白的方法示意圖，據(jù)此找到3個潛在蛋白：EWSR1，ELAVL1和SYNCRIP。pull-down實驗在未轉染的細胞中只能檢測到內(nèi)源性和外源性circ-CUX1，以及EWSR1與circ-CUX1復合物，而另外兩個蛋白或者相互作用均未能檢測到（Fig 4B）。
   進一步證實circ-CUX1和EWSR1存在相互作用及共定位（Fig 4C-D），以及RNA電泳遷移率檢測和GST標記證實EWSR1蛋白與circ-CUX1相互作用，且是與的RNA識別基序(RRM)域而不是與p200 CUX1或CASP轉錄本相互作用（Fig 4E-F）。以上結果表明circ-CUX1與EWSR1蛋白在NB細胞直接相互作用。

5、Circ-CUX1促進了EWSR1介導的MAZ活化
   為進一步研究circ-CUX1的靶基因，作者進行了RNA-seq，發(fā)現(xiàn)過表達circ-CUX1后，IMR32細胞中有781個上調基因和434個下調基因（Fig 5A）。從中篩選到5個差異顯著的轉錄因子，然后從BioGRID數(shù)據(jù)庫中提取的與EWSR1相互作用的蛋白做進一步的重疊分析，發(fā)現(xiàn)MAZ蛋白是參與這一過程的唯一轉錄因子（Fig 5B）。此外，標記MAZ的鋅指結構域與EWSR1的相互作用是必需的，但不是N端或C端。實驗發(fā)現(xiàn)，circ-CUX1的過表達或敲除相應增加或減少了IMR32和SH-SY5Y細胞中EWSR1和MAZ的相互作用(Fig 5C和D)。
   在IMR32和SH-SY5Y細胞中，circ-CUX1的過表達或敲除相應增強和減少了MAZ與這5個靶基因啟動子的結合，而當EWSR1的沉默或過表達則可以消除這些作用（Fig 5E）。熒光素酶實驗顯示野生型CUX1，MAZ結合位點的啟動子活性受circ- CUX1異位表達或敲低的影響而升高或降低，而突變型則不受影響（Fig 5F）。此外，穩(wěn)定轉染circ-CUX1或shcirc-CUX1＃1的IMR32和SH-SY5Y細胞中CUX1，S100A9，MUC4，KLF10或TXNIP的水平發(fā)生了顯著變化（Fig 5G和H）。敲除或過表達EWSR1或MAZ可挽救腫瘤細胞的這些變化（Fig 5F-H）。這些數(shù)據(jù)表明，circ-CUX1促進了NB細胞中EWSR1介導的MAZ反式激活和靶基因的轉錄改變。

6、治療肽阻斷circ-CUX1-EWSR1相互作用
   作者基于EWSR1的RRM結構域在與circ-CUX1相互作用中的重要性設計了一種可穿透細胞的肽，即EWSR1抑制肽（EIP-22） ，可以阻止circ-CUX1-EWSR1交互作用（Fig 6A）。 用EIP-22處理SH-SY5Y細胞導致其在細胞核內(nèi)明顯聚集（Fig 6B）。此外，EIP-22處理減少了circ-CUX1和EWSR1之間的相互作用，但不減少pri-miR-222和EWSR1之間的相互作用或circACC1和AMP激活的蛋白激酶1的相互作用（Fig 6C和D）。施用EIP-22可抑制SH-SY5Y細胞的活力、增殖和侵襲（Fig 6E和F），同時改變circ-CUX1下游基因表達。
   靜脈內(nèi)施用EIP-22可顯著降低小鼠皮下異種移植腫瘤的生長、重量，Ki-67增殖指數(shù)和CD31陽性微血管，改變circ-CUX1目標基因的表達，并降低葡萄糖攝取，乳酸鹽產(chǎn)生和ATP水平（Fig 6G）。此外，施用EIP-22可減少小鼠肺轉移量，并延長裸鼠的存活時間（Fig 6H）。這些數(shù)據(jù)表明，EIP-22通過阻止circ-CUX1-EWSR1相互作用來抑制NB進程。

   之后，作者進一步驗證了circ-CUX1敲除對異種移植腫瘤裸鼠的治療效果，結果顯示裸鼠的腫瘤重量和大小，Ki-67增殖指數(shù)和CD31陽性微血管都下降了，并改變了circ-CUX1目標基因的表達，此外，小鼠的葡萄糖攝取，乳酸鹽產(chǎn)生，ATP水平，肺部轉移都顯著下降。以上表明，在小鼠體內(nèi)，慢病毒介導的circ-CUX1敲低可抑制好氧糖酵解和NB的進展。
   總之，本文確定了CUX1為轉錄因子，可促進NB中糖酵解基因ENO1，GPI和PGK1的表達。證明circ-CUX1與EWSR1蛋白相互作用以增加MAZ反式激活，后者隨后調節(jié)CUX1和其他與順式和反式與腫瘤進展相關的基因的轉錄（Fig 6I），例如S100A9、MUC4、KLF10和TXNIP。本文中circ-CUX1 / EWSR1 / MAZ軸的發(fā)現(xiàn)代表了對腫瘤進行治療性干預前進了有希望的一步。
參考文獻：
   Li Huanhuan., Yang Feng., Hu Anpei., Wang Xiaojing., Fang Erhu., Chen Yajun., Li Dan., Song Huajie., Wang Jianqun., Guo Yanhua., Liu Yang., Li Hongjun., Huang Kai., Zheng Liduan., Tong Qiangsong.(2019). Therapeutic targeting of circ-CUX1/EWSR1/MAZ axis inhibits glycolysis and neuroblastoma progression. EMBO Mol Med, 11(12), e10835. doi:10.15252/emmm.201910835