快看過來：circRNA測序結合機制實驗輕松發(fā)14分文章啦！

   越來越多的證據(jù)表明，單鏈環(huán)狀RNA（circRNA）在包括肝細胞癌（HCC）的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。但是，尚不清楚circRNA在HCC轉移中起何種作用。 在這項研究中，作者通過circRNA測序，確定了circASAP1，它與HCC患者根治性切除術后的肺轉移有關。本文于2019年12月發(fā)表在Hepatology (IF:14.971)。
結果如下：
1、鑒定circASAP1參與了HCC轉移和預后
   對15例有肺轉移和無肺轉移的組織進行circRNA-seq，獲得其差異表達的circRNA聚類熱圖和火山圖（圖1A-B）。其中最顯著上調的包括circASAP1，其來源如圖1C。qRT-PCR檢測結果顯示，三個circRNA中，只有circASAP1在轉移性肺癌細胞系中顯著高表達，且高表達circASAP1患者的總體生存期更短，復發(fā)率更高?？傊Y果提示circASAP1參與了HCC轉移和預后。

2、CircASAP1促進HCC轉移和進展
   如圖2A-D所示，circASAP1過表達促進了HepG2和PLC/PRF/5細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲。圖2E和F顯示，敲除circASAP1顯著降低了小鼠的肝腫瘤和肺轉移結節(jié)。以上說明circASAP1促進HCC轉移和進展。

3、CircASAP1海綿吸附miR-326和miR-532-5p
   作者采用RNA免疫沉淀法檢測circASAP1與AGO2的結合，結果顯示AGO2抗體可顯著富集circASAP1(圖3A)，說明circASAP1被納入RNA誘導的沉默復合物中。使用circASAP1特異性探針進行circRNA下拉實驗，qRT-PCR檢測到18個miRNA的富集，其中miR-326和miR-532-5p的含量顯著高于其它miRNA(圖3B)。如圖3C和D所示，circASAP1和miR-326，miR-532-5p之前確實存在結合，以及共定位。以上證實，circASAP1可通過海綿吸附miR-326和miR-532-5p。

4、 CircASAP1通過海綿miR-326和miR-532-5p促進HCC轉移和進展
   作者實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-326或miR-532-5p可抑制HCCLM3細胞的增殖、遷移和侵襲能力，干擾其表達則相反。此外，抑制miR-326或miR-532-5p表達可以減輕circASAP1敲除引起的HCCLM3細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力下降(圖4B)，相反地，過表達miR-326或miR-532-5p則可廢止過表達circASAP1引起的生物學反應(圖4A)。此外，小鼠體內模型實驗具有相似的結果(圖4C和4D)，提示circASAP1通過海綿miR-326和miR-532-5p促進HCC轉移和進展。

5、在HCC細胞中circASAP1通過海綿吸附miR-326和miR-532-5p提高CSF-1和MAPK1的表達
   HCCLM3細胞中過表達miR-326或miR-532-5p均可顯著降低CSF-1和MAPK1的mRNA和蛋白水平（圖5A-D）。熒光素酶結果顯示，miR-326和miR-532-5p均可顯著抑制野生型3 -UTRs的CSF-1和MAPK1的熒光素酶活性，但對突變型則無影響(圖5E)。此外，在HCC樣本中，miR-326和miR-532-5p水平與CSF-1和MAPK1 mRNA表達呈顯著負相關(圖5F)。綜上所述，在HCC細胞中，CSF-1和MAPK1是miR-326和miR-532-5p的直接靶點。
   之后作者研究了circASAP1是否調控CSF-1和MAPK1的表達。qRT-PCR、western blot、ELISA結果顯示，circASAP1過表達時，CSF-1、MAPK1表達升高，敲除circASAP1后，表達降低(圖5G、5H、5I)。此外，miR-326和/或miR-532-5p的過表達顯著逆轉了circASAP1過表達誘導的CSF-1分泌和MAPK1表達增加；類似的，敲除miR-326和/或miR-532-5p則有相反的效果（圖5J）。在肝癌組織中CSF-1和MAPK1的mRNA表達水平與circASAP1水平呈正相關（圖5K）。以上結果表明，在HCC細胞中circASAP1通過海綿吸附miR-326和miR-532-5p來增強CSF-1和MAPK1的表達。

6、CircASAP1通過調控miR-326/miR-532-5p-MAPK1信號軸來促進HCC細胞的增殖和侵襲
   MAPK1又名ERK2，通過ERK1/2途徑發(fā)揮其功能，是眾所周知的腫瘤啟動子在肝細胞癌中上調表達。作者發(fā)現(xiàn)ERK1/2抑制劑SCH772984在不影響總ERK1/2蛋白水平的情況下，以劑量依賴性的方式顯著降低ERK1/2磷酸化水平(圖6A)。此外，SCH772984能以劑量依賴的方式阻斷circASAP1誘導的肝癌細胞增殖、遷移和侵襲(圖6B和C)。這些結果表明，circASAP1通過調控MAPK1的表達，影響ERK1/2信號通路，促進HCC細胞的增殖和侵襲。
   另一方面，作者發(fā)現(xiàn)circASAP1通過調節(jié)miR326/miR-532-5p-CSF-1信號來介導腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的浸潤(圖6D和E)。circASAP1通過CM促進了巨噬細胞從PLC/PRF/5細胞的增殖和遷移，下調則效果相反(圖6F和G)。小鼠模型試驗顯示下調miR326/miR-532-5緩解了因異種移植中circASAP1基因敲除誘導的TAM浸潤；而過表達miR-326/miR-532-5p可消除circASAP1誘導的F4/80+ TAMs在PLC/PRF/5異種移植物中的浸潤(圖6H)。這些結果表明，circASAP1通過調控miR-326/miR-532-5p-CSF-1信號通路來促進TAM細胞的浸潤。

7、CircASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs對HCC患者有預后價值
   為了確定circASAP1、CSF-1、MAPK1和CD68+ TAMs在HCC中的臨床意義，作者使用380例HCC原發(fā)腫瘤組織的組織芯片檢測了這些因子的表達。圖7A是典型案例圖。circASAP1水平高的HCC腫瘤CSF-1和MAPK1表達水平高，TAM浸潤增多（圖7B）。高circASAP1表達水平患者的1年、3年和5年生存率顯著低于circASAP1低表達水平患者，類似的，circASAP1高表達水平患者預后差，復發(fā)率高（圖7C）?？傊琧ircASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs對HCC患者有預后價值。

   總之，本文所講述的故事如圖7D所示，CircASAP1在HCC中通常上調表達，circASAP1與miR-326/miR-532-5p結合，降低其豐度，進一步抑制其靶基因CSF-1、MAPK1的表達，其中MAPK1通過ERK1/2信號通路，促進HCC細胞的增殖和侵襲，CSF-1則促進TAM細胞的浸潤。
參考文獻：
   Hu Zhi-Qiang., Zhou Shao-Lai., Li Jia., Zhou Zheng-Jun., Wang Peng-Cheng., Xin Hao-Yang., Mao Li., Luo Chu-Bin., Yu Song-Yang., Huang Xiao-Wu., Cao Ya., Jia Fan., Zhou Jian., (2019). Circular RNA Sequencing Identifies CircASAP1 as a Key Regulator in Hepatocellular Carcinoma Metastasis., Hepatology, undefined, undefined.