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   NH3是一種已知的有害氣體，會(huì)對(duì)我們的呼吸系統(tǒng)造成傷害。NH3存在于陰霾中，會(huì)形成二次有機(jī)氣溶膠，進(jìn)入呼吸道對(duì)健康產(chǎn)生不利影響。但是，尚未確定由NH3引起的氣管的具體損害機(jī)制。ceRNA調(diào)控機(jī)制及其多種作用已在許多病理機(jī)制中提出。本文作者以肉雞為材料，研究了NH3吸入后ceRNA在雞氣管中的功能作用。本文于2019年11月發(fā)表在Journal of Hazardous Materials（IF：7.65）上。
本文思路如下圖所示：

本文研究結(jié)果如下：
1、氣管細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察
   如圖1，透射電鏡下正常對(duì)照（C組）氣管細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜邊緣清晰完整，線粒體大小正常，無(wú)異常結(jié)構(gòu)變化。 然而，NH3暴露組（H組）具有許多細(xì)胞壞死的典型特征，包括集中的纖毛細(xì)胞核，核仁缺乏，線粒體腫脹，空泡化，甚至細(xì)胞質(zhì)破裂，伴隨細(xì)胞膜破裂。以上證實(shí)，NH 3可以誘導(dǎo)氣管細(xì)胞壞死。

                                              圖1 用透射電鏡(TEM)觀察暴露于NH3的氣管

2、lncRNAs和miRNAs的聚類(lèi)分析
   RNA測(cè)序中鑒定出79個(gè)差異表達(dá)的lncRNA（DE-lncRNA）（圖2A）和21個(gè)差異表達(dá)的miRNA（DE-miRNA）（圖2C）。此外，作者發(fā)現(xiàn)lncRNA-107053293和miR-148a-3p（圖2 B，紅色方框所示）在調(diào)控NH3代謝過(guò)程中可能是重要的功能原件，因而以此為目標(biāo)進(jìn)行下一步分析。

                                              圖2 lncRNAs和miRNAs的聚類(lèi)分析

3、lncRNA-107053293和miR-148a-3p對(duì)NH3暴露后氣管中FAF1表達(dá)的影響
   圖3 A是作者篩選的5條顯著差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其中l(wèi)ncRNA-107053293差異最顯著。此外，qRT-PCR顯示miR-148a-3p在H組中顯著上調(diào)表達(dá)（圖3B）。miR-148a-3p的靶基因FAF1（已知的抑制細(xì)胞凋亡）在H組中顯著下調(diào)表達(dá)（圖3C和D）。所以作者猜測(cè)氣管在暴露于NH3引發(fā)的凋亡可能與lncRNA-107053293和miR-148a-3p有關(guān)。

                                        圖3 lncRNA-107053293、miR-148a-3p、FAF1在氣管中的表達(dá)水平

4、NH3暴露后氣管內(nèi)壞死相關(guān)基因的表達(dá)
   基于FAF1的表征，作者檢測(cè)了RIPK1，RIPK3，MLKL，F(xiàn)ADD和caspase 8的表達(dá)，這些蛋白均與細(xì)胞壞死有關(guān)。正如預(yù)期，暴露于NH3后，氣管中RIPK1，RIPK3，MLKL和FADD表達(dá)都升高了。并且在mRNA水平上，F(xiàn)ADD，RIPK1和RIPK3表達(dá)升高超過(guò)2倍，而MLKL增加1.5倍，caspase 8減少約60％（圖4A）。類(lèi)似的，上述蛋白的蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)得出一致的結(jié)論（圖4B）。結(jié)合前人的研究，caspase 8下調(diào)細(xì)胞壞死會(huì)增加，因此，作者得出結(jié)論，NH3暴露后可能通過(guò)激活caspase 8引發(fā)氣管壞死。

                                               圖4 檢測(cè)導(dǎo)致氣管組織壞死的基因

5、lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用網(wǎng)絡(luò)
   亞細(xì)胞定位顯示lncRNA-107053293主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖5A），之后構(gòu)建了lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1組件，如圖5B，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示三者之間確實(shí)存在結(jié)合位點(diǎn)可相互作用（圖5C和D）。
   此外，過(guò)表達(dá)lncRNA-107053293，miR-148a-3p的表達(dá)顯著下調(diào)，但FAF1表達(dá)水平顯著升高（圖5E和F）。相反，miR-148a-3p過(guò)表達(dá)lncRNA-107053293和FAF1的豐度都下降了，而FAF1蛋白水平下降的更為明顯（圖5G）。以上表明， lncRNA-107053293可通過(guò)螯合miR-148a-3p來(lái)調(diào)節(jié)FAF1的表達(dá)。

                                     圖5 lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用網(wǎng)絡(luò)

6、氯化銨致LMH（雞肝細(xì)胞癌細(xì)胞系）壞死
   作者摸索了不同濃度氯化銨用于NH3暴露的最佳濃度，如圖6A， 50 mM氯化銨殺死了一半的細(xì)胞，所以作者最終選擇5 mM濃度的氯化銨，此時(shí)細(xì)胞存活率大于95％。此外，流式結(jié)果顯示對(duì)照組中只有0.559％的細(xì)胞壞死，而當(dāng)暴露于氯化銨時(shí)，有25.3％的細(xì)胞壞死（圖6B）。

                                                 圖6 CCK-8和流式檢測(cè)的結(jié)果
   為了驗(yàn)證上述結(jié)果，作者檢測(cè)了氣管細(xì)胞中壞死相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，如圖7A和B所示，氯化銨模擬的NH3暴露后，組織中FADD和MLKL表達(dá)增幅最大，其次是RIPK1和RIPK3。以上結(jié)果表明氯化銨可導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

                                                   圖7壞死相關(guān)基因的表達(dá)
   總之，本文進(jìn)一步闡明了氨致雞氣管損傷的生物學(xué)機(jī)制，為氨毒理學(xué)研究奠定了更深層次的理論基礎(chǔ)。此外，本文的實(shí)驗(yàn)手段并不復(fù)雜，但發(fā)了7分的雜志，值得借鑒。
參考文獻(xiàn)：
   Wang Wei., Shi Qunxiang., Wang Shengchen., Zhang Hongfu., Xu Shiwen., (2019). Ammonia regulates chicken tracheal cell necroptosis via the LncRNA-107053293/MiR-148a-3p/FAF1 axis., J. Hazard. Mater., undefined, 121626.