miR-541通過抑制自噬增強(qiáng)人肝癌對索拉非尼治療的反應(yīng)

   自噬在HCC中也起著多方面的作用，包括促進(jìn)腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長、促進(jìn)轉(zhuǎn)移以及對索拉非尼治療的適應(yīng)性反應(yīng)。miR-541的臨床意義及其對自噬的影響尚未被探討。在這里，小編與大家分享一篇近期發(fā)表與Gut上的文章“miR-541 potentiates the response of human hepatocellular carcinoma to sorafenib treatment by inhibiting autophagy”。在本項研究中，我們通過調(diào)節(jié)miR-541啟動的miRNA-自噬軸，研究了肝癌細(xì)胞對索拉非尼致敏的可行性。

結(jié)果：
1.miR-541的下調(diào)與HCC患者生存期的縮短和復(fù)發(fā)的增加有關(guān)
   我們首先通過在www. kmplot. com上搜索來研究miR-541在HCC患者中的預(yù)后價值。發(fā)現(xiàn)較低的miR-541水平與HCC患者較短的總生存期（OS）相關(guān)（圖1A）。我們使用RT-PCR進(jìn)一步驗證了miR-541在HCC中的表達(dá)的臨床意義。研究表明，與周圍非腫瘤肝組織相比，腫瘤組織中miR-541的表達(dá)明顯下降（圖1B）。在大多數(shù)病例中觀察到miR-541的下調(diào)（圖1C）。臨床病理分析表明，miR-541在人肝癌細(xì)胞中的下調(diào)與侵襲性臨床病理特征顯著相關(guān)。與www. kmplot. com上的結(jié)果一致，這些HCC樣本中較低的miR-541水平也與HCC患者較短的OS相關(guān)（圖1D）。此外，低miR-541表達(dá)組的復(fù)發(fā)率明顯高于高miR-541表達(dá)組（圖1 E）。關(guān)鍵的是，我們證實低水平的miR-541與較短的無復(fù)發(fā)生存期相關(guān)（圖1F）。基于這些數(shù)據(jù)，miR-541的表達(dá)在臨床上與癌癥復(fù)發(fā)和患者預(yù)后相關(guān)。

2.miR-541在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞的惡性特性
   我們通過轉(zhuǎn)染miR-541模擬物或miR-541抑制劑的細(xì)胞，在體外評估了miR-541對人肝癌細(xì)胞系各種惡性特性的影響。過表達(dá)miR-541可顯著抑制體外肝癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲（圖2A-E）。相反，miR-541的抑制增加了HCC細(xì)胞的惡性表型。
   在HCC皮下植入腫瘤模型中，所有接受細(xì)胞感染Ad-Max的小鼠在接種后第4天即檢測到移植瘤，而接受細(xì)胞感染Ad-miR-541的小鼠僅觀察到一個結(jié)節(jié)。此外，Ad-miR- 541組的腫瘤生長和腫瘤重量顯著降低（圖2F-H）。另外，我們還通過向NOD/SCID小鼠體內(nèi)注射被Ad-miR- 541或Ad-Max感染的熒光素酶標(biāo)記的YY-8103細(xì)胞，研究了miR-541對體內(nèi)HCC轉(zhuǎn)移的影響。使用體外成像在Ad-Max組的9只小鼠中有5只在骨骼中檢測到熒光素酶信號，但在Ad-miR-541組的10只小鼠中只有10只中有2只在骨骼中檢測到（圖2I，J）。同樣，在Ad-Max組的9只老鼠中，3只老鼠的肺中檢測到了熒光素酶信號，而在Ad-miR- 541組的10只老鼠中，只有1只老鼠的肺中檢測到了熒光素酶信號。組織學(xué)分析證實Ad-miR- 541組的骨和肺中存在較小的腫瘤病灶（圖2K）。這些數(shù)據(jù)表明，miR-541在HCC中具有強(qiáng)大的腫瘤抑制作用。

3.miR-541在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞的自噬
   我們研究了miR-541對HCC細(xì)胞自噬的影響。研究表明miR-541過表達(dá)降低了HCC細(xì)胞中LC3 II的水平，提高了P62的水平（圖3A）。相反，miR-541的抑制增加了LC3 II的水平，降低了P62在HCC細(xì)胞中的表達(dá)。免疫化學(xué)染色顯示，與經(jīng)Ad-Max處理的異種移植相比，經(jīng)Ad-miR- 541處理的皮下異種移植中LC3陽性腫瘤細(xì)胞較少，P62陽性腫瘤細(xì)胞較多（圖3 B，C）。TEM表明Ad-miR-541肝癌細(xì)胞的自噬小體數(shù)量減少（圖3 D，E）。此外，使用mRFP-GFP-LC3報告基因構(gòu)建的活細(xì)胞成像顯示，自噬通量的速率被miR-541過表達(dá)顯著抑制，被miR-541耗竭增強(qiáng)（圖3F，G）。

4.ATG2A和RAB1B是miR-541的兩個直接靶點
   我們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以識別可能參與自噬的miR-541候選mRNA靶點，并探討miR-541抑制自噬的機(jī)制。分析顯示miR-541與ATG2A和RAB1B之間的miRNA-target相互作用，它們是自噬的重要調(diào)控因子（圖4A，B）。有趣的是，miR-541異位表達(dá)后，肝癌細(xì)胞中ATG2A和RAB1B mRNA和蛋白水平下降，miR-541抑制后則升高（圖4 C，D）。通過miRNA預(yù)測程序，我們確定了ATG2A mRNA的3’UTR中miR-541的兩個預(yù)測結(jié)合位點，以及RAB1B mRNA的3’UTR中miR-541的四個潛在結(jié)合位點（圖4 A，B）。與我們的預(yù)測一致，miR-541的過表達(dá)降低了含有野生型ATG2A和RAB1B 3’UTR的構(gòu)建體的熒光素酶活性，而3’UTR上所有靶序列的點突變均減弱了miR-541對熒光素酶活性的影響，這表明這兩個基因代表miR-541的直接靶標(biāo)（圖4E，F(xiàn)）。此外，western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測到，miR-541水平的升高伴隨著ATG2A和RAB1B蛋白表達(dá)的降低（圖4 G，H）。在HCC樣本中，ATG2A和RAB1B水平與miR-541水平呈負(fù)相關(guān)（圖4I，J）

5.ATG2A和RAB1B在HCC細(xì)胞中具有致癌作用并促進(jìn)自噬
   迄今為止，ATG2A和RAB1B在HCC中的真實作用尚不清楚。為了研究miR-541發(fā)揮抗腫瘤作用的潛在分子機(jī)制，我們首先在www. kmplot. com中檢測了這兩個基因在HCC患者中的預(yù)后價值。生存曲線顯示ATG2A和RAB1B mRNA的高表達(dá)與較差的預(yù)后之間存在關(guān)聯(lián)，這與miR-541的臨床意義相反（圖5 A，B）。接下來，我們使用針對ATG2A和RAB1B的siRNAs來研究它們的影響。結(jié)果表明，siATG2A和siRAB1B抑制增殖、集落形成、遷移和侵襲（圖5C-I）。此外，siATG2A和siRAB1B降低了LC3 II的水平，增加了P62在HCC細(xì)胞中的表達(dá)（圖5 J）和阻止自噬小體合成（圖5 K，L）?；谶@些結(jié)果，我們認(rèn)為ATG2A和RAB1B是HCC自噬的癌基因和陽性調(diào)節(jié)因子。

6.miR-541通過下調(diào)ATG2A和RAB1B來抑制HCC中自噬的進(jìn)展
   通過共轉(zhuǎn)染miR-541抑制劑和siATG2A或siRAB1B進(jìn)行了一系列拯救試驗，以進(jìn)一步研究miR-541介導(dǎo)的HCC抑制的分子機(jī)制。 在轉(zhuǎn)染siATA2A和siRAB1B的細(xì)胞中，miR-541抑制劑對增加HCC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的作用顯著降低（圖6A-F）。 siATG2A和siRAB1B逆轉(zhuǎn)了miR-541抑制劑促進(jìn)自噬的作用（圖6G，H）。 總體而言，ATG2A和RAB1B的下調(diào)至少部分有助于miR-541對HCC細(xì)胞的功能作用。

7.miR-541增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞體內(nèi)外死亡
   考慮到自噬在加重索拉非尼耐藥中的關(guān)鍵作用，我們隨后研究了miR-541對HCC細(xì)胞對索拉非尼敏感性的影響。我們初步探討了miR-541表達(dá)對HCC患者對索拉非尼反應(yīng)的顯著影響。對miR-541低表達(dá)或高表達(dá)的患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示miR-541高表達(dá)的HCC患者可從索拉非尼治療中獲益，而miR-541低表達(dá)的患者則不能獲益（圖7A）。此外轉(zhuǎn)染了miR-541模擬物的HCC細(xì)胞對索拉非尼的敏感性高于對照組細(xì)胞，其表現(xiàn)為50%的抑制濃度（IC50）降低，而轉(zhuǎn)染了miR-541抑制劑的細(xì)胞對索拉非尼的耐受性高于對照組細(xì)胞，其表現(xiàn)為IC50的升高（圖7B-E）。最后，我們評估Ad-miR-541治療是否會加強(qiáng)索拉非尼對HCC的影響。裸鼠皮下移植HCC細(xì)胞，接受Ad-Max或Ad-miR- 541的瘤內(nèi)注射，以及索拉非尼或vehicle DMSO的腹腔注射。Ad-miR- 541和索拉非尼均抑制腫瘤的生長、體積和重量（圖7 F-H）。值得注意的是，Ad-miR-541和索拉非尼的聯(lián)合使用產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，與對照組相比，最大程度地抑制了腫瘤的生長。免疫組織化學(xué)染色顯示，與Ad-Max和DMSO處理的腫瘤相比，Ad-miR-541治療或索拉非尼治療的腫瘤中Ki-67陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，而Ad-miR-541和 索拉非尼聯(lián)合使用進(jìn)一步降低了Ki-67水平（圖7I）。 此外，與對照組相比，用Ad-miR-541或Ad-miR-541和索拉非尼的聯(lián)合治療可導(dǎo)致ATG2A和RAB1B的表達(dá)明顯降低，而與對照組（Ad-Max +DMSO）相比，索拉非尼治療可可顯著提高ATG2A和RAB1B的表達(dá)。 總而言之，miR-541增強(qiáng)了索拉非尼對HCC生長的抑制作用，這至少部分歸因于其對ATG2A和RAB1B表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

結(jié)論：
   本研究強(qiáng)調(diào)了miR-541在HCC中的生物學(xué)意義，闡明了一個以前未被認(rèn)識的HCC進(jìn)展的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為HCC的個體化治療提供了三個新的治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物。推進(jìn)基于miR-541的術(shù)后檢測和治療干預(yù)的轉(zhuǎn)譯研究將使HCC患者受益。