外泌體-----外傷性O(shè)NFH細(xì)胞療法的一種新選擇

導(dǎo)語：
外泌體能夠攜帶反映疾病狀況的多種遺傳分子，在細(xì)胞通訊過程中扮演著一個(gè)“快遞員”的重要角色，由于其較低的免疫原性，致瘤性和更易于管理，因此外泌體已成為疾病細(xì)胞療法的一種有前途的新選擇。外傷性股骨頭壞死(ONFH)是導(dǎo)致股骨頭塌陷的一種情況，其主要治療方法為全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，預(yù)后較差。但是外泌體卻能為外傷性O(shè)NFH的治療提供了一種可能的策略。
技術(shù)路線：
1.通過微陣列分析，篩選外傷性O(shè)NFH相關(guān)表達(dá)數(shù)據(jù)集獲得差異表達(dá)基因(DEGs)和差異表達(dá)miRs，
2.收集外傷性和非外傷性外傷性腦脊液瘤患者，并進(jìn)行隨訪。
3.純化和鑒定了BM-MSCs來源的外泌體，然后與外泌體共培養(yǎng)HUVECs。
4.驗(yàn)證miR-224-3p在外傷性O(shè)NFH中的功能作用是通過異位表達(dá)、耗竭和再通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定。
5.評(píng)估內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力和血管生成
6.通過芯片分析驗(yàn)證在ONFH中miR-224-3p表達(dá)以及證實(shí)FIP200是miR-224-3p的靶基因。
7.驗(yàn)證外泌體mir -224- 3p對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力、血管生成和FIP200表達(dá)。
8.最后證明FIP200過表達(dá)促進(jìn)了血管生成
研究結(jié)果：
1、BM-MSCs發(fā)現(xiàn)有間質(zhì)表型
   在光學(xué)顯微鏡下,觀察到,BMMSCs通道4是同質(zhì)漩渦的形狀。流式細(xì)胞儀檢測(cè),積極的CD90率是97.4%,CD34是0.091%,表明BM-MSCs特定的間質(zhì)表型,但沒有造血表型。

2、外泌體被血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化
   Nanosight分析表明，純化的外泌體直徑范圍在30到100 nm之間。通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，純化后的外泌體呈圓形，直徑約50 nm，說明囊泡的主要成分可能是外泌體。檢測(cè)到外泌體特異性標(biāo)志物CD9、CD63和CD81。孵育后，標(biāo)記為綠色熒光的外泌體被內(nèi)在化，主要定位于內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，表明外泌體被血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)在化。

3、外傷性O(shè)NFH-Exo促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成
   將HUVECs分別與創(chuàng)傷性O(shè)NFH-Exo和con-Exo孵育，以確定外泌體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。進(jìn)行了EdU和mtt分析。外傷性O(shè)NFH-Exo較conExo明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。此外，我們使用基質(zhì)凝膠法評(píng)估血管生成能力。結(jié)果表明,與con-Exo相比,創(chuàng)傷ONFH-Exo增加分支點(diǎn)的數(shù)量和總管的長度。劃痕試驗(yàn)表明,與con-Exo相比,創(chuàng)傷ONFH-Exo表現(xiàn)出顯著增加區(qū)域的細(xì)胞遷移。與此同時(shí),Transwell化驗(yàn)的結(jié)果表現(xiàn)出更多的入侵細(xì)胞創(chuàng)傷ONFH-Exo比con-Exo。最后,上述結(jié)果提示創(chuàng)傷性O(shè)NFH-Exo具有促進(jìn)血管生成的作用。

4、MiR-224-3p通過調(diào)節(jié)FIP200影響外傷性O(shè)NFH
   從GSE89587表達(dá)數(shù)據(jù)集中篩選出差異表達(dá)的miRs(補(bǔ)充表S1)，選取前10個(gè)下調(diào)的miRs繪制表達(dá)熱點(diǎn)圖。利用microRNA數(shù)據(jù)整合門戶(mirDIP)、microRNA靶相互作用數(shù)據(jù)庫(miRTarBase)和DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR224-3p的靶基因，分別得到267、113和1031個(gè)靶基因。此外，從外傷性O(shè)NFH的表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE74089中篩選出631個(gè)DEGs。然后，將DEGs與miR-224-3p的靶基因進(jìn)行比較，繪制Venn圖。確認(rèn)存在一個(gè)交集基因，即RB1誘導(dǎo)卷曲線圈1 (RB1CC1)。RBCC1在外傷性O(shè)NFH中的差異表達(dá)可被miR-224-3p調(diào)控。GSE74089表達(dá)數(shù)據(jù)的前30個(gè)DEGs的表達(dá)熱圖示外傷性O(shè)NFH患者RB1CC1表達(dá)高于對(duì)照組。定量RT-PCR (qRT-PCR)結(jié)果證實(shí)，外傷性O(shè)NFH前5個(gè)miRs (miR-4711-3p、-122-5p、-122-3p、-3191- 5p、-224-3p)表達(dá)下調(diào)，其中miR-224-3p表達(dá)最多，約為80%。RB1CC1也被稱為FIP200。這些結(jié)果表明，miR-224-3p在創(chuàng)傷性O(shè)NFH中調(diào)節(jié)FIP200。

5、 miR-224-3p的下調(diào)促進(jìn)創(chuàng)傷性O(shè)NFH血管生成
   mir -224-3pmimic或抑制劑被送入HUVECs進(jìn)行功能分析。模擬NC組、抑制劑NC組與對(duì)照組在edui陽性細(xì)胞、OD值、分支點(diǎn)數(shù)量、總管長度、細(xì)胞遷移面積、侵襲細(xì)胞數(shù)量等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比,EdU-positive細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞減少的OD值mir - 224 - 3 - P模擬組,而他們顯著增加mir - 224 - 3 - P抑制劑組(P< 0.05)。然而,管形成能力減少themir - 224 - 3 - pmimic集團(tuán),而這顯然增加了mir - 224 - 3 - P抑制劑組(P<0.05)。相對(duì)于模擬數(shù)控,抑制劑數(shù)控,和對(duì)照組,miR-224-3p模擬組細(xì)胞遷移面積和侵襲細(xì)胞數(shù)量減少，而miR-224-3p抑制劑組則相反(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，miR-224-3p的下調(diào)可能促進(jìn)創(chuàng)傷性O(shè)NFH血管生成。

6、 MiR-224-3p下調(diào)通過靶向FIP200促進(jìn)血管生成
   在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站揭示了MiR-224-3p和FIP200之間存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-224-3p和FIP200野生型后，熒光素酶活性顯著下降。qRT-PCR結(jié)果顯示，與mimicNC組相比，miR-224-3p mimic組miR-224-3p水平顯著升高;然而，與抑制劑NC組相比，miR-224-3p抑制劑組對(duì)miR-224-3p表達(dá)有顯著的抑制作用(P<0.05)。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，與mimicNC相比，miR-224-3p模擬組中FIP200和VEGF表達(dá)被抑制，而miR-224-3p抑制劑組中FIP200和VEGF表達(dá)被促進(jìn)(P<0.05)。構(gòu)建FIP200過表達(dá)載體。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與載體組相比，F(xiàn)IP200過表達(dá)組FIP200和VEGF的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與con- Exo組相比，外傷性O(shè)NFH-Exo組mir -224- 3p表達(dá)明顯降低(P<0.05)， FIP100表達(dá)升高(P<0.05)。這些結(jié)果表明miR-224-3p通過負(fù)調(diào)控FIP200抑制血管生成。

7、下調(diào)miR-224-3p可促進(jìn)體內(nèi)血管生成
   建立了創(chuàng)傷性onfh大鼠模型，模型組股骨頭組織內(nèi)可見大面積壞死骨，空洞集中。對(duì)照組可見骨細(xì)胞和罕見的空洞。術(shù)后1天，從外傷性O(shè)NFH患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肌注分離的外泌體和miR-224-3p inhibitor或mimic。HE染色顯示，外傷性O(shè)NFH-Exo+ control組、外傷性O(shè)NFH-Exo+ mimicNC組、外傷性O(shè)NFH-Exo+抑制劑組中，股骨頭以凋亡骨為主，活骨與死骨交替存在。外傷性O(shè)NFH-Exo + miR-224-3p模擬組主要表現(xiàn)為死骨和少量骨細(xì)胞，而外傷性O(shè)NFH-Exo + miR-224-3p抑制劑組主要表現(xiàn)為正常骨細(xì)胞，表現(xiàn)為罕見的死骨。外傷性O(shè)NFH-Exo +對(duì)照組、外傷性O(shè)NFH-Exo +模擬NC組和外傷性O(shè)NFH-Exo +抑制劑NC組FIP200和VEGF蛋白水平無明顯差異(P>0.05)。FIP200的蛋白質(zhì)含量和VEGF在創(chuàng)傷性顯著降低ONFH-Exo + mir - 224 - 3 - P模仿組與創(chuàng)傷ONFH-Exo +模擬數(shù)控組相比,而他們是顯著增加traumaticONFH-Exo + mir - 224 - 3 - P抑制劑組與創(chuàng)傷ONFH-Exo +抑制劑NC組(P<0.05)。這些研究結(jié)果表明,抑制mir - 224 - 3 - P表達(dá)ONFH老鼠體內(nèi)促進(jìn)血管生成。

總結(jié)：
   mm - mscs分泌miR-224-3p抑制外泌體，調(diào)節(jié)外傷性O(shè)NFH血管生成。在ONFH中，miR-224-3p在來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體中的表達(dá)被下調(diào)，從而促進(jìn)FIP200的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成、遷移和侵襲，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管生成以預(yù)防ONFH。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體作用于內(nèi)皮細(xì)胞。外泌體中miR- 224-3p可抑制FIP200的表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、微血管生成和血管生成。當(dāng)創(chuàng)傷性O(shè)NFH發(fā)生時(shí)，來自BM-MSCs的外泌體中miR-224-3p的表達(dá)下調(diào)，從而上調(diào)FIP200，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。
   總之，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-224-3p的下調(diào)，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，侵襲能力，下調(diào)miR-224-3p水平通過上調(diào)FIP200促進(jìn)創(chuàng)傷性O(shè)NFH的血管生成。此研究結(jié)果強(qiáng)烈建議mir - 224 - 3 - p可以作為一種潛在的分子治療創(chuàng)傷性O(shè)NFH的目標(biāo)，但需要更大的樣本量的研究來驗(yàn)證目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以開發(fā)臨床價(jià)值。