原來(lái)lncRNA阻礙侵襲也不一定是好事！

   Pumilio（PUM）蛋白是高度保守的RNA結(jié)合蛋白家族的成員，該家族在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)許多生物體中的基因表達(dá)。但是，它們?cè)谔ケP(pán)中的作用尚不清楚。胚胎著床時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞粘附在母體子宮內(nèi)膜上，然后侵入母體子宮內(nèi)膜，最終形成胎盤(pán)。目前，在人類(lèi)胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了兩種主要的滋養(yǎng)細(xì)胞譜系:絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和外滲滋養(yǎng)細(xì)胞（EVTs）。EVT的侵襲是胚胎植入和胎盤(pán)形成的重要過(guò)程。EVT侵襲不充分和子宮螺旋動(dòng)脈重構(gòu)受損是子癇前期（PE）發(fā)生的啟動(dòng)因素。本文確定了一種新的RNA調(diào)控機(jī)制，揭示了在PE發(fā)病機(jī)理中，調(diào)控PUM1 / HOTAIR在滋養(yǎng)細(xì)胞入侵中調(diào)控的新途徑，并于今年12月發(fā)表在Molecular Therapy (IF: 8.402)。
主要結(jié)果如下：
1、PE患者滋養(yǎng)細(xì)胞中PUM1表達(dá)水平升高
   收集妊娠中期絨毛組織，探討PUM1和PUM2在PE發(fā)病中的作用，PUM1在PE中的mRNA和蛋白水平均上調(diào)（Fig 1A-B）。此外，與HC組相比，早發(fā)型PE組和晚發(fā)型PE組的絨毛組織中PUM1陽(yáng)性信號(hào)更強(qiáng)（Fig 1C-F）?？傊琍UM1在PE患者滋養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)。

                                                           圖1 PE患者滋養(yǎng)細(xì)胞中PUM1表達(dá)水平升高

2、PUM1抑制HTR-8細(xì)胞的增殖和侵襲
   如圖2所示，與對(duì)照組相比，干擾PUM1后HTR-8細(xì)胞的增殖和侵襲能力顯著升高，表明PUM1抑制HTR-8細(xì)胞的增殖和侵襲。

                                                                 圖2 PUM1抑制HTR-8細(xì)胞的增殖和侵襲

3、在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞外植體培養(yǎng)模型中PUM1弱化了EVTs的入侵和遷移能力
   為進(jìn)一步研究PUM1在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中的作用，從新鮮妊娠早期胎盤(pán)組織中分離出細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(CT)和侵襲性滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT)。采用qRT-PCR檢測(cè)妊娠早期胎盤(pán)絨毛組織及CT、EVT細(xì)胞的PUM1 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EVT細(xì)胞中PUM1 mRNA的表達(dá)水平低于CT細(xì)胞，表明PUM1可能在體內(nèi)調(diào)控EVT的侵襲中發(fā)揮重要作用。
   然后研究PUM1是否對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的體外遷移能力有影響。從妊娠前3個(gè)月(妊娠6-10周)的胎盤(pán)中取出胎盤(pán)絨毛，分成兩組，在涂有基質(zhì)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，siCtrl和siPUM1組之間沒(méi)有觀察到顯著差異。體外培養(yǎng)72h后，siPUM1處理的外植體比siCtrl處理的外植體遷移得更遠(yuǎn)（圖3A和3B）。全量免疫熒光染色顯示了胎盤(pán)絨毛中PUM1的沉默效率（圖3C和3D）。
   為了進(jìn)一步闡明PUM1對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵的調(diào)控，從健康的絨毛中獲得新鮮外植體，并將其分為兩組。結(jié)果表明，lenti-PUM1處理的外植體的遷移能力低于lenti-ctrl處理的外植體（圖3E和3F）。綜上，PUM1抑制EVT入侵并支持PUM1可能是PE的關(guān)鍵介體的觀點(diǎn)。

                                                               圖3 PUM1減少了外植體中滋養(yǎng)層的生長(zhǎng)

4、HOTAIR是PUM1在滋養(yǎng)層中的一個(gè)下游基因
   為了闡明PUM1在PE發(fā)病機(jī)制中調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制，將HTR-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染siCtrl或siPUM1后培養(yǎng)48h的細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序，得到178個(gè)差異表達(dá)lncRNA，與對(duì)照相比，siPUM1中101個(gè)上調(diào)77個(gè)下調(diào)（圖4A）；其中22個(gè)lncRNA的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化 (圖4B)，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，有12個(gè)的表達(dá)模式一直（圖4C）。用PUM1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HTR-8細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果顯示，lncRNAs HOTAIR、HAGLR和CTD-2228K2.7在PUM1過(guò)表達(dá)組滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)較低；與此相反，MEG3、SNHG1、SNHG6和linc01085在PUM1過(guò)表達(dá)的滋養(yǎng)細(xì)胞中顯著升高(圖4D)。之后，使用RIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有HOTAIR顯著富集（圖4E）。此外，敲低PUM1可顯著促進(jìn)HOTAIR在HTR-8細(xì)胞中的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)PUM1可降低HOTAIR的表達(dá)(圖4F和4G)?？傊琍UM1在胞質(zhì)內(nèi)與HOTAIR特異性相互作用，調(diào)節(jié)HOTAIR的表達(dá)。

                                                              圖4 PUM1下調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)

5、PUM1在滋養(yǎng)細(xì)胞中調(diào)節(jié)HOTAIR的表達(dá)和穩(wěn)定性
   為了進(jìn)一步闡明PUM1調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)的潛在分子機(jī)制，根據(jù)UGUARAUA共有序列，在HOTAIR的第六個(gè)外顯子區(qū)域（0.5 2.3 kb）中預(yù)測(cè)了四個(gè)PUM1結(jié)合位點(diǎn)，這些PUM1結(jié)合位點(diǎn)稱(chēng)為A，B，C和D（圖5A）。熒光素酶結(jié)果顯示，在對(duì)照組和PUM1沉默下，HTR-8細(xì)胞中MUT C的熒光素酶活性，特別是MUT D報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著增加（圖5B和5C），表明HOTAIR第六外顯子區(qū)域中的位點(diǎn)C和D是PUM1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。RIP結(jié)果顯示，與IgG組相比，HOTAIR的C和D位點(diǎn)顯著降低了抗PUM1組的HOTAIR富集（圖5D），這些表明，HOTAIR的C和D位是結(jié)合PUM1蛋白的主要位點(diǎn)。RNA親和純化實(shí)驗(yàn)證實(shí)PUM1與HOTAIR特異性相互作用（圖5E）。此外，轉(zhuǎn)染siPUM1后，HOTAIR的半衰期較長(zhǎng)，但當(dāng)用過(guò)表達(dá)PUM1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，HOTAIR的半衰期較短（圖5F和5G），揭示了PUM1對(duì)HOTAIR RNA穩(wěn)定性的強(qiáng)烈影響。綜上，PUM1在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控HOTAIR。

                                                          圖5 PUM1是HOTAIR滋養(yǎng)細(xì)胞中重要的RNA結(jié)合蛋白

6、HOTAIR在PE中下調(diào)表達(dá)并與PUM1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
   作者此前發(fā)現(xiàn)，HOTAIR通過(guò)激活PI3K- AKT信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PUM1敲低或HOTAIR過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了Ser473的AKT磷酸化，而PUM1過(guò)表達(dá)或HOTAIR敲低大大降低了AKT的磷酸化。此外，用HOTAIR過(guò)表達(dá)加PUM1過(guò)表達(dá)處理HTR-8細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)PUM1過(guò)表達(dá)對(duì)AKT磷酸化的影響。相反，用HOTAIR siRNA加PUM1 siRNA處理HTR-8細(xì)胞也明顯逆轉(zhuǎn)了HOTAIR敲低對(duì)AKT磷酸化的作用（圖6A和6B）。
   此外，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)PUM1的HTR-8細(xì)胞和原代滋養(yǎng)細(xì)胞中侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而HOTAIR的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由PUM1過(guò)表達(dá)引起的對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞入侵的影響（圖6C-6F）。進(jìn)一步驗(yàn)證PE患者和HCs中滋養(yǎng)細(xì)胞中HOTAIR和PUM1 mRNA的表達(dá)水平，和預(yù)期一致，與HC組相比，PE組的滋養(yǎng)細(xì)胞中PUM1 mRNA的水平明顯較高，而HOTAIR的水平顯著較低（圖6G和6H）。線性相關(guān)分析表明，絨毛組織中HOTAIR水平與PUM1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)（圖6I）。綜上所述，PUM1 / HOTAIR / p-AKT途徑在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞入侵中具有重要的功能。

                                                       圖6 PUM1/HOTAIR/AKT通路參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲
   總之，本文表明PUM1是HOTAIR表達(dá)和滋養(yǎng)細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)控因子。首先，在PE中，PUM1上調(diào)，HOTAIR下調(diào)。其次，HOTAIR是滋養(yǎng)層遷移和入侵的有效調(diào)節(jié)因子，而在PE患者中，該過(guò)程不受控制。最后，AKT磷酸化的下調(diào)伴隨著PUM1過(guò)表達(dá)后遷移和侵襲的減少。