系統(tǒng)性紅斑狼瘡造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析

    造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs）是多能性細(xì)胞，可產(chǎn)生髓系和淋巴系。我們認(rèn)為系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）免疫細(xì)胞異常可以追溯到HSPCs。HSPCs通過(guò)髓樣偏移對(duì)炎癥刺激作出積極反應(yīng)，但這可能導(dǎo)致疲勞、功能下降、炎癥風(fēng)險(xiǎn)增加、適應(yīng)性免疫下降和心血管死亡率增加。今天小編為大家?guī)?lái)最新發(fā)表于Translational science雜志上的文章“Transcriptome reprogramming and myeloid skewing in haematopoietic stem and progenitor cells in systemic lupus erythematosus”。在本研究中，我們通過(guò)RNA測(cè)序、通路富集分析，構(gòu)建骨髓源性HSPCs的全球基因表達(dá)圖譜，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSPCs的細(xì)胞周期狀態(tài)和凋亡狀態(tài)，通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)DNA損傷情況。

結(jié)果：
1.小鼠狼瘡HSPCs的轉(zhuǎn)錄譜表現(xiàn)為髓樣偏倚
    為了研究HSPCs在SLE中是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄改變，我們使用小鼠模型NZBW/F1。年齡相當(dāng)?shù)拇菩訡57BL/6小鼠作為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)從NZBW/F1狼瘡和C57BL/6對(duì)照小鼠髓樣中篩選HSPCs，并在LSK室中進(jìn)行基因分析（圖1A）。共鑒定了F1-P和F1-L小鼠之間的758個(gè)差異表達(dá)基因（圖1B）。在F1-L小鼠中，基因集富集分析顯示與炎癥反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)激活和血小板脫顆粒相關(guān)的信號(hào)呈正相關(guān)（圖1C）。值得注意的是，F(xiàn)1-L小鼠中LSK表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖和較強(qiáng)的髓特征（圖1D）。IFN相關(guān)基因（Gbp6和Ciita）在F1-L LSK中上調(diào)，表現(xiàn)出強(qiáng)I型IFN信號(hào)，這是活性SLE的一個(gè)標(biāo)志（圖1D）?？傊@些轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)1-L LSK向髓系/粒細(xì)胞系的增殖和分化增強(qiáng)。

2.小鼠狼瘡HSPCs細(xì)胞的活性增殖和復(fù)制應(yīng)激
    為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們分析了髓樣LSK腔室及其亞群。與F1-P相比，F(xiàn)1-L小鼠的LSK增加了近兩倍（圖2A，B）。在LSK室，F(xiàn)1-L小鼠中，短期造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞的頻率更高（圖2A，C）。在穩(wěn)定狀態(tài)下，HSPCs相對(duì)靜止，維持一個(gè)低數(shù)量的循環(huán)細(xì)胞，這些細(xì)胞將分化為成熟的血細(xì)胞。狼瘡LSK細(xì)胞周期分析顯示，與B6-O對(duì)照組相比，在G0期，F(xiàn)1-L LSK細(xì)胞增殖增加，數(shù)量減少（圖2D）。此外，與B6相比，狼瘡LSK表現(xiàn)出更多的雙鏈DNA斷裂（圖2E），這表明狼瘡小鼠的LSK處于復(fù)制應(yīng)激狀態(tài)。

3.狼瘡疾病進(jìn)展中CMPs的分化停滯
    為了描述LSK期后的造血分化，我們對(duì)每個(gè)譜系的祖細(xì)胞進(jìn)行了描述。F1-L組CMPs增加2.5倍，而與F1-P組相比，GMPs減少2倍（圖3A）。接著，為了進(jìn)一步研究骨髓分化的調(diào)控，我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析。721個(gè)DEGs中的大部分在F1-L CMPs中下調(diào)(圖3B)。另外，髓樣標(biāo)志物下調(diào)，而增殖標(biāo)志物無(wú)差異表達(dá)（圖3C）。DEGs參與了與髓磷脂介導(dǎo)免疫、粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞遷移和補(bǔ)體激活相關(guān)的通路。因此，我們檢查了特異性粒細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)（圖3D）。在F1-L CMPs中，IL-1家族的趨化因子和調(diào)節(jié)因子被下調(diào)。主要調(diào)節(jié)因子如Cebpe，Cebpd，Csf3r和Csf2rα在CMPs F1-L階段被抑制（圖3 D）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果提示骨髓祖細(xì)胞水平的分化停滯。

4.狼瘡BM中中性粒細(xì)胞增多
    鑒于分化停滯，我們假設(shè)終末分化細(xì)胞可能會(huì)減少。然而，與F1-P相比，F(xiàn)1-L小鼠的中性粒細(xì)胞增加了1.6倍，而B(niǎo)M的單核細(xì)胞水平與之相當(dāng)（圖4A，B）。衰老比對(duì)照組小鼠中性粒細(xì)胞增加1.16倍。與之相反，F(xiàn)1-L小鼠血液和脾臟中性粒細(xì)胞明顯減少（圖4C，D）。

5.人SLE CD34+轉(zhuǎn)錄組表現(xiàn)為活躍的增殖和髓樣偏移
    接下來(lái)，我們研究是否可以追蹤人類疾病中的狼瘡LSK信號(hào)。為此，我們從女性SLE和HC患者的BM中純化CD34+細(xì)胞。我們?cè)赟LE和HC患者中鑒定出2364個(gè)DEGs，其中包含832個(gè)上調(diào)基因和1532個(gè)下調(diào)基因（圖5A）。SLE患者淋巴樣標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，而髓樣標(biāo)志物在患者體內(nèi)表達(dá)變化較大（圖5B）。此外，系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD34+細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)擴(kuò)散，而GSEA與ATR在復(fù)制應(yīng)激、細(xì)胞周期和DNA依賴的DNA復(fù)制下的激活呈正相關(guān)（圖5C）。針對(duì)增強(qiáng)擴(kuò)散，γ-H2AX評(píng)估檢查CD34+細(xì)胞是否存在增殖壓力。結(jié)果表明，SLE HSPCs表現(xiàn)出更多的雙鏈DNA斷裂（圖5D）。亞組分析顯示，嚴(yán)重和中度SLE患者髓樣標(biāo)志物存在變化（圖5E）。值得注意的是，與中度疾病患者相比，重度SLE患者粒細(xì)胞生成特異性標(biāo)志物如CEBPZ、CEBPD、GATA2的表達(dá)增加（圖5E），這與我們?cè)谛∈罄钳廘SK中的發(fā)現(xiàn)一致。GSEA與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和嚴(yán)重SLE患者的運(yùn)動(dòng)的正調(diào)節(jié)呈正相關(guān)（圖5F）。利用上調(diào)的基因?qū)?yán)重SLE患者進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化和遷移過(guò)度（圖5G）?？傊?，與HC相比，HSPCs在SLE患者中被激活和增殖，在重癥患者中有明顯的轉(zhuǎn)錄分化。

6.人類狼瘡CD34+與小鼠狼瘡CMP轉(zhuǎn)錄組的比較顯示了在祖細(xì)胞期阻滯的共同特征
    接下來(lái)，我們將人類CD34+轉(zhuǎn)錄組與LSK和CMP數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。我們發(fā)現(xiàn)LSK DEGs和CMPs DEGs與人類CD34+ DEGs存在顯著重疊（圖6A，B）。在人類SLE患者中，小鼠LSK和人類CD34+細(xì)胞共享的DEGs大部分下調(diào)，而在小鼠狼瘡患者中沒(méi)有下調(diào)（圖6C）。然而，小鼠CMPs與人類CD34+細(xì)胞間的共同DEGs表達(dá)存在共性（圖6D）。因此，SLE CD34+轉(zhuǎn)錄組特征更容易讓人聯(lián)想到小鼠狼瘡CMPs而不是小鼠狼瘡LSK。使用RNEA，我們發(fā)現(xiàn)狼瘡CMPs和CD34+ SLE細(xì)胞中有15個(gè)被抑制的調(diào)節(jié)因子。其中，有重大疾病特定效應(yīng)器如IFNγ和il - 6等，以及干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)分化平衡的調(diào)節(jié)因子如Ets1和Pax5（圖6 E）?？偟膩?lái)說(shuō)，狼瘡患者的CD34+細(xì)胞在小鼠狼瘡CMPs的轉(zhuǎn)錄譜中表現(xiàn)出更多的共性。

結(jié)論：
    系統(tǒng)性紅斑狼瘡的免疫細(xì)胞異?？梢宰匪莸絹?lái)源骨髓的HSPCs。HSPCs的啟動(dòng)和異常的骨髓生成調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致炎癥和耀斑的風(fēng)險(xiǎn)。