TAF1-急性髓系白血病的治療靶點

    TAF1在參與細胞周期和凋亡的基因表達中起著關鍵作用。研究表明賴氨酸43（K43）在AE上被p300乙?；贏E誘導的白血病中起關鍵作用，并且TAF1優(yōu)先與乙酰化的AE肽相互作用。那么小編給大家介紹一篇發(fā)表于nature communications上的文章“TAF1 plays a critical role in AML1-ETO driven leukemogenesis”，讓大家具體了解TAF1在白血病發(fā)生中的作用。

結果：
1.AE表達細胞的增殖需要TAF1
    為了闡明TAF1在AE表達細胞增殖中的作用，我們使用了兩種不同的TAF1 shRNA來降低Kasumi-1和SKNO-1兩種AML細胞系中TAF1的表達。通過TAF1的敲低抑制了這些細胞的增殖，表明TAF1對這些細胞的生長至關重要。另外，我們在不表達AE的K562白血病細胞系和CD34+ CB細胞中敲除TAF1。發(fā)現(xiàn)這兩種細胞中TAF1表達的減少與Kasumi-1細胞的減少相當；然而，降低TAF1的表達對這些細胞的增殖幾乎沒有影響（圖1a-d）。因此，TAF1在AE表達細胞的生長中起著特殊的作用。為了評估TAF1對細胞增殖的影響，我們使用BrdU標記細胞并使用流式細胞術測量細胞周期。TAF1的敲低降低了Kasumi-1細胞在S期的比例，但對K562細胞和CD34+細胞在S期的比例沒有影響（圖1e-h），因此，TAF1對AE表達細胞的增殖尤為重要。

2.TAF1的敲低促進髓細胞分化，損害自我更新
    我們檢測了人類細胞中Mac-1（CD11b）的表達以及小鼠細胞中Mac-1和Gr-1的表達，發(fā)現(xiàn)在兩種情況下，AE引起的髓細胞分化阻滯被TAF1敲低部分緩解。相比之下，TAF1敲低對無AE細胞的骨髓分化或這些標志物的表達影響不大（圖2a，b）。綜上所述，TAF1參與了髓細胞分化的阻滯。連續(xù)重復菌落形成測定和鵝卵石區(qū)域形成測定（CAFC）實驗表明TAF1敲低明顯抑制了AE驅動的序列復制能力和CAFC形成（圖2c-e）。這些結果表明，TAF1促進AE誘導的HSPC自我更新。

3.TAF1敲低抑制AE9a+細胞的增殖和自我更新
    為了確定TAF1敲低對表達AE9a的白血病細胞的影響，我們開發(fā)了AE9a+熒光素酶+細胞系，并使用如圖3a所示的次級脾白血病細胞。結果表明，TAF1的缺失損害了AE9a+白血病細胞的生長（圖3b，c）。連續(xù)重復菌落形成測定和鵝卵石區(qū)域形成測定（CAFC）實驗表明TAF1敲低降低了白血病細胞的集落形成，減少了鵝卵石樣區(qū)形成細胞（CAFCs）的數量（圖3d，e），說明TAF1對于維持AE9a+白血病干細胞的自我更新和頻率至關重要。

4.TAF1在AE9a誘導的白血病發(fā)生中起關鍵作用
    為了確定TAF1是否參與AE9a驅動的體內白血病發(fā)生，我們使用兩種不同的TAF1定向shRNA敲除AE9a+熒光素酶+小鼠骨髓細胞系中的TAF1。注射TAF1 敲低的AE9a+細胞的小鼠存活時間明顯長于注射表達野生型TAF1水平的AE9a+細胞的小鼠（圖4a），這表明TAF1在白血病發(fā)展中起關鍵作用。進一步，我們使用IVIS成像系統(tǒng)檢測小鼠AE9a+白血病細胞的生長。發(fā)現(xiàn)接受TAF1 敲低的AE9a+熒光素酶+細胞的小鼠中只有1/16檢測到熒光素酶信號（圖4b，c）。為了進一步證明TAF1缺失會影響小鼠白血病細胞的生長，我們使用流式細胞術對注射3周后外周血中標記為AE9a+熒光素酶+的GFP細胞數量進行了量化，發(fā)現(xiàn)TAF1 敲低的GFP+細胞數量明顯減少（圖4d）。我們也注射了AE9a+白血病細胞，接受TAF1 敲低的細胞的小鼠存活時間更長，外周血中GFP+ AE9a+細胞明顯減少（圖4e，f）?？傊@些數據表明TAF1在AE9a誘導的白血病發(fā)生中起關鍵作用，并可能成為抗白血病治療的潛在靶點。

5.TAF1與AE相關
    為了確定內源性TAF1蛋白是否與白血病細胞中的全長AE相關，我們使用抗TAF1和抗ETO抗體進行了互惠共免疫沉淀。如圖5a, b所示，我們在Kasumi-1細胞中檢測到TAF1與AE的物理相互作用。之后我們使用Kasumi-1細胞進行TAF1免疫沉淀后的質譜分析,并證實TAF1不僅結合AE，CBFβ，p300，還結合AE代數余子式SIN3A和HDAC1等（表1）。由于賴氨酸43（K43）在AE上的乙酰化對AE驅動的白血病是至關重要的，我們檢查了TAF1與AE結合是否需要賴氨酸43 (K43)的乙酰化。如圖5c所示，AE中賴氨酸-43突變?yōu)榫彼幔钄嗔薃E與TAF1的相互作用。因此，賴氨酸-43乙?；瘜E與TAF1的相互作用至關重要。為了確定TAF1中的溴域是否對識別AE上的K43乙?；痍P鍵作用，我們刪除了TAF1的兩個溴域，發(fā)現(xiàn)這消除了TAF1與AE的關聯(lián)（圖5d）。因此，TAF1通過其溴域與AE上的乙?；嚢彼?43結合。

6.AE靶基因的表達受TAF1缺失的影響
    鑒于TAF1在介導AML細胞AE作用中的重要性，我們探討了TAF1的敲低如何影響AE調控的基因表達。ID1和MYC是AE激活基因，我們證實它們在Kasumi-1細胞中被AE敲低下調表達（圖6a）。接下來，我們發(fā)現(xiàn)TAF1在不降低AE表達水平的情況下也顯著降低了這些基因的表達（圖6b，d）。我們還利用AE9a+小鼠細胞系，發(fā)現(xiàn)TAF1的缺失會影響ID1和MYC的表達(圖6c)。另外我們發(fā)現(xiàn)36%的AE激活基因因TAF1敲低而下調（圖6e）。KEGG分析表明，這些基因參與了DNA復制、RNA剪接、RNA運輸、細胞周期、核苷酸代謝和核糖體生物發(fā)生。令人驚訝的是，TAF1敲低也上調了許多基因，其中26%的基因在AE敲低后上調（圖6f）。顯然，TAF1對于AE激活基因和被抑制基因的一個子集的表達至關重要，這暗示了TAF1在調節(jié)AE靶基因表達方面的獨特作用。

7.TAF1是AE與染色質結合的關鍵
    為了評估TAF1在AE染色質沉積中的作用，我們生成了含有或不含TAF1敲低的Kasumi-1細胞亞細胞組分。如圖7a所示，TAF1敲低對AE在染色質上結合的影響具有特異性。為了研究TAF1和AE在整個基因組中是否共定位于AE靶基因，我們在Kasumi-1細胞中使用抗AML1-ETO抗體和抗TAF1抗體進行ChIP-seq。如圖7b所示，AE峰廣泛分布于遠端基因間區(qū)、啟動子區(qū)和內含子，而TAF1峰大部分位于啟動子區(qū)，這可能反映了TAF1在PIC中的作用。此外我們發(fā)現(xiàn)58%的TAF1峰與AE峰重疊，而19%的AE峰與TAF1峰重疊（圖7c）。KEGG分析表明，重疊的峰值與急性和慢性髓系白血病相關的基因和癌癥中的通路相鄰。大部分重疊AE和TAF1峰位于轉錄起始位點(附近（圖7d）。然而，從TSS(非TSS)可以看到大量的重疊峰（圖7e）。非TSS的TAF1/AE重疊峰約60%位于假定的增強子上。這說明了TAF1/AE復合物在這些通路中的重要性。鑒于p300的乙?；饔脤AF1和AE的相互作用至關重要，我們研究了p300是否與TAF1和AE共享空間。如圖7f所示，28%的AE/TAF1共存區(qū)域也有p300結合，如ID1基因的增強子(圖7g)?？傊?，這些數據表明，TAF1與AE在啟動子和增強子區(qū)域的結合對AE靶基因的一個子集的表達至關重要，這些AE靶基因與細胞周期和白血病有關。

8.TAF1抑制降低了表達AE的細胞的增殖
    鑒于TAF1在AE細胞增殖中的重要作用，我們檢測了bay364和bay299對Kasumi-1、K562和CD34+細胞生長的影響。如圖8a，d所示，與CD34+細胞或K562細胞相比，Kasumi-1細胞對bay364處理更敏感，其生長受到的影響最小。與此相反，bay299可抑制Kasumi-1細胞的生長，但對CD34+細胞和K562細胞有類似的作用（圖8b, d）。JQ-1比bay364更能抑制Kasumi-1細胞的生長(圖8c)；然而，它對Kasumi-1細胞和CD34+細胞有類似的作用。接下來，我們使用經bay364或vehicle處理3天的Kasumi-1細胞檢測bay364對AE介導的基因表達的影響。bay364可降低ID1和MYC的表達，但不影響AE的表達，與TAF1敲低作用相似（圖8e）。為了評估第二個TAF1 結構域在控制TAF1和AE調控基因中的重要性，我們將TAF1敲低和AE敲低實驗的RNA-seq數據與Kasumi-1細胞的RNA-seq數據進行了比較?？偟膩碚f，由TAF1敲低和AE敲低鑒定的39%的AE和TAF1調節(jié)的基因也受TAF1溴域抑制劑的控制。這些基因在細胞周期、DNA復制、代謝和凋亡中發(fā)揮作用（圖8g）。此外，bay364處理顯著影響AE9a+細胞的集落形成（圖8f）。綜上所述，通過調節(jié)AE靶基因的一個關鍵子集，第二個TAF1結構域似乎對AE表達細胞的生存和集落形成具有選擇性的重要性。

結論:
    在本研究中，我們證實TAF1與白血病細胞AE相關，TAF1的KD的下調破壞了自身的更新，促進了AML細胞的髓樣分化和凋亡，從而阻礙了白血病細胞的生長。此外，TAF1的缺失降低了AE與染色質的聯(lián)系及其調控AE激活基因和抑制基因表達的能力?？傊@些結果揭示了TAF1在AE驅動的白血病發(fā)生中的獨特作用， TAF1有可能成為表達急性骨髓性白血病的治療靶點。