Ferrostatin-1抑制鐵死亡的機(jī)制
鐵死亡是一種由鐵和脂質(zhì)氫過氧化物引發(fā)的細(xì)胞死亡，并由GPx4預(yù)防。 (Fer-1)比酚類抗氧化劑更有效地抑制鐵死亡。先前對(duì)Fer-1抗氧化效率的研究采用了動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，其中重氮化合物產(chǎn)生被抗氧化劑清除的氫過氧自由基。然而，這種反應(yīng)，考慮到斷鏈效應(yīng)，對(duì)于描述亞鐵和脂質(zhì)氫過氧化物依賴的過氧化的抑制作用幫助很小。
最近，一篇名為“Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1”的文章在雜志Redox Biology上發(fā)表，闡述了在亞鐵存在的情況下，GPx4和Fer-1通過不同的機(jī)制產(chǎn)生最相關(guān)的抗鐵死亡效應(yīng)，即起始脂質(zhì)氫過氧化物的消失。
摘要：
通過清除脂質(zhì)氫過氧化物自由基，產(chǎn)生脂質(zhì)氫過氧化物，亞鐵引發(fā)新的過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。研究者們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Fer-1抑制脂質(zhì)體中由鐵和微量脂質(zhì)氫過氧化物引發(fā)的過氧化反應(yīng)時(shí)，由預(yù)先存在的微量氫過氧化物產(chǎn)生的氧化物的模式實(shí)際上與在沒有抗氧化劑的情況下觀察到的徹底過氧化后觀察到的模式相同。這支持了Fer-1的抗鐵死亡活性實(shí)際上是由清除脂質(zhì)過氧化氫生成的亞鐵與其它重排產(chǎn)物所產(chǎn)生的烷氧基自由基的觀點(diǎn)。值得注意的是，F(xiàn)er-1在抑制鐵依賴的脂質(zhì)過氧化的同時(shí)不被消耗。新出現(xiàn)的概念是，是亞鐵本身減少了Fer-1自由基。這一點(diǎn)得到了電分析證據(jù)的支持，即Fer-1與鐵形成復(fù)合物，并通過鈣黃綠素的熒光在細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)，表明Fer-1的存在降低了不穩(wěn)定的鐵。通過量子力學(xué)計(jì)算，還研究了鐵抑素-鐵配合物的偽催化循環(huán)的概念，證實(shí)了Fer-1還原烷氧基自由基模型和亞鐵還原Fer-1自由基。
技術(shù)總結(jié)：
一. Ferrostatin-1和trolox具有明顯不同的脂質(zhì)過氧化抑制效率，而具有相同的斷鏈抗氧化作用
比較trolox和Fer-1的抗氧化能力：I）產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化氫自由基的重氮化合物；II）抗壞血酸亞鐵從脂質(zhì)體中存在的微量脂質(zhì)過氧化氫引發(fā)過氧化反應(yīng)。將含有0.1 mM磷脂的擠出脂質(zhì)體分散體(SLPC 18：0/18：2和SLPE 18：0/18：2，比例1：1)引入氧合細(xì)胞，并在存在FER-1或trolox的情況下與空氣平衡。通過添加：ABIP或FeSO4-抗壞血酸啟動(dòng)過氧化。
圖1A表明，在ABIP存在的情況下，F(xiàn)er-1和trolox具有相同的斷鏈能力(IC50分別=1.66μM和1.86μM，圖1C)。相反，當(dāng)Fe2+引發(fā)過氧化時(shí)，F(xiàn)ER-1比trolox更有效(IC50分別=0.017μM和7.2μM，圖1B和C)。結(jié)論：在模擬FT中發(fā)生的脂質(zhì)過氧化模型中，脂質(zhì)氫過氧化物自由基的清除效率并不反映抗氧化能力。
圖一：鐵或重氮在脂質(zhì)體中誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的抑制。初始耗氧速率比R/R0與Trolox(藍(lán)色空心圓)和FER-1(紅色實(shí)心圓)濃度的關(guān)系符合Eq方程。含有0.1mM磷脂(SLPC：SLPE/1：1)，不同量的trolox或Fer-1的脂質(zhì)體溶液被8 mM ABIP(A組)或30μM抗壞血酸和4μM FeSO4(B組)在0.1MTris，0.15MKCl，pH7.0，在37°C時(shí)氧化。報(bào)告(C)從面板A和B計(jì)算的IC50值。
二. 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的脂質(zhì)組學(xué)分析
鑒定基于MS/MS光譜，結(jié)合保留時(shí)間。作為基本參考化合物，使用ALOX15產(chǎn)生的氫過氧化物，并用Gpx4-GSH還原。表1報(bào)告了檢測(cè)到的最相關(guān)(>0.1%)氧化物種的列表。
表一：用氧化脂質(zhì)組學(xué)鑒定SLPC的氧化種類。所有物種都是由亞油酸產(chǎn)生的。在PLPC、SLPC和PLPE中檢測(cè)到相同的物種。通過保留時(shí)間和MS/MS進(jìn)行鑒定。
當(dāng)脂質(zhì)體被重氮化合物或Fe2+過氧化時(shí)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的模式有很大的不同。30分鐘后，約20%的磷脂被氧化修飾，氫過氧化物占重氮化合物氧化產(chǎn)物的70%，而鐵引發(fā)的過氧化物不超過30%。
圖二：重氮化合物或Fe2+/抗壞血酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化模式。在時(shí)間0(T0)和用ABIP8 mM或Fe2+4μM加抗壞血酸30μM孵育30分鐘后，測(cè)量相對(duì)于1-硬脂酰基-2-亞油?；?sn-甘油-3-磷脂啉(SLPC)的含有0.1 mM磷脂的新鮮脂質(zhì)體懸浮液(SLPC：SLPE/1：1)的氧化脂質(zhì)模式。在插圖中總結(jié)了總氧化種類占SPLC總量的百分比(左)和脂氫過氧化物占氧化種類總數(shù)的百分比(右)。數(shù)值代表20個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
當(dāng)Fe2+引發(fā)過氧化時(shí)，30分鐘后脂質(zhì)氫過氧化物仍是主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，但也產(chǎn)生大量的環(huán)氧酮、環(huán)氧羥基、酮、羥基、環(huán)氧氫過氧化物。Fe2+誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的時(shí)間過程(圖3A)顯示所有的過氧化產(chǎn)物逐漸增加，而脂質(zhì)體制劑中最初存在的脂質(zhì)氫過氧化物(t=0)在暴露于Fe2+時(shí)突然減少，然后逐漸增加。這一結(jié)果完全符合脂質(zhì)烷氧基自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化的機(jī)制。當(dāng)鐵依賴的脂質(zhì)過氧化被FER-1抑制時(shí)(圖3B)，脂質(zhì)體中存在的脂質(zhì)氫過氧化物消失，產(chǎn)生一系列氧化物種，其模式與不抑制過氧化時(shí)觀察到的模式相同(圖3A)。這一證據(jù)與fer1最相關(guān)的反應(yīng)是清除激活脂質(zhì)過氧化的PL-O?的觀點(diǎn)一致。相反，對(duì)PL-OO?的清除，即斷鏈效應(yīng)，與增殖競(jìng)爭(zhēng)，但也穩(wěn)定了可逆的氧添加，生成新的過氧化氫，鐵由此引發(fā)新的過氧化鏈反應(yīng)。
圖三：Fe2+誘導(dǎo)SLPC氧化模式的時(shí)間進(jìn)程，以及Fer-1效應(yīng)。含有0.1mM磷脂(SLPC：SLPE/1：1)的脂質(zhì)體懸浮液與Fe2+4μM和抗壞血酸30μM在不存在(A)或存在(B)0.5μM FER-1的情況下孵育30分鐘。在添加前(T0)和添加后0.5，2，10，30分鐘提取樣品。在插圖中，總結(jié)了總氧化種類占SPLC總量的百分比(左)和脂氫過氧化物占氧化種類總和的百分比(右)。數(shù)值表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖四：Fe2+誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化機(jī)制的示意圖。
三. Ferrostatin-1可以抑制過氧化反應(yīng)而不被消耗
Fer-1在抑制鐵誘導(dǎo)的過氧化時(shí)沒有被消耗。0.5μM FER-1在鐵驅(qū)動(dòng)的過氧化氫分解過程中不消耗，即使在存在15μM脂質(zhì)氫過氧化物的情況下也是如此(圖5)。假設(shè)：與烷氧基相互作用產(chǎn)生的fer1自由基可以被還原回來。驗(yàn)證：亞鐵是這個(gè)反應(yīng)中的電子供體。首先通過電分析測(cè)量Fer-1與鐵的相互作用，然后通過量子力學(xué)計(jì)算氧化還原過程的能量學(xué)來驗(yàn)證該假設(shè)。其次，通過鈣黃綠素?zé)晒庾C實(shí)了Fer-1與鐵在細(xì)胞中形成復(fù)合物。
圖五：脂質(zhì)過氧化分解和鐵存在下的Fer1消耗。含有0.1mM磷脂(SLPC：SLPE/1：1)的溶液在pH7.4的0.1MTris，0.15MKCl中，通過用Alox15預(yù)處理60min富集氫過氧化物，在37℃下用0.5 μMFer-1，30μM抗壞血酸和4μMFeSO4處理。用質(zhì)譜對(duì)總PL-OOH(s正方形■) 和FER-1(三角形▼) 的時(shí)間過程進(jìn)行了定量?？瞻资蔷彌_區(qū)中的FER-1(圓形●).
四. Fer-1與鐵相互作用的電分析
在90%甲醇和LiClO4緩沖液(0.1M)中進(jìn)行微分脈沖伏安法(DPV)測(cè)量。將Fe2+或Fe3+逐步加入到100μM FER-1，并記錄產(chǎn)生的電流。在鐵的存在下，F(xiàn)ER-1的兩個(gè)氧化峰都向更正的電位(陽極位移)移動(dòng)(圖6A和B)。峰電位的這些位移(ΔVP=VpFer-1+Fe-VpFer-1)取決于FER-1/Fe比率，滿足預(yù)期的飽和動(dòng)力學(xué)(圖6C和D)。得到的雙曲線方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合較好。
圖六：鐵和亞鐵離子對(duì)fer-1陽極峰值電位值的影響。在沒有和存在不同的亞鐵(A)和鐵離子(B)離子濃度的情況下，F(xiàn)er-1的微分脈沖伏安圖顯示了由鐵引起的fer-1峰電位值的陽極移動(dòng)。示出了峰電位(ΔVp=VpFer-1+Fe-VpFer-1)在Fe2+/FER-1(C)和Fe3+/FER-1(D)上的移動(dòng)圖；連續(xù)線是通過非線性回歸分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙曲線方程最佳擬合的結(jié)果。
五. Fer-1的氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)機(jī)制
DFT分析表明，F(xiàn)ER-1可以通過N個(gè)孤對(duì)與鐵結(jié)合。在模型中，配位球被三個(gè)Cl陰離子飽和，因此總分子電荷為-1。值得注意的是，因?yàn)橹挥兄侔種與鐵結(jié)合，所以配合物是四配位的(圖7A)。它的電子基態(tài)是五重奏，特征是四個(gè)電子在金屬中心平行自旋。該配合物可以通過氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)機(jī)制減少自由基。在計(jì)算分析中，分別使用CH3O·和CH3OO·作為脂烷氧基和氫過氧自由基(PL-O·和PL-OO·)的模型。在仲胺N位上的自由基形成比在伯胺N位上更穩(wěn)定。通過分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，鐵(II)被氧化成鐵(III)，N原子帶負(fù)電荷。在這個(gè)復(fù)合體中，總的多重性是一個(gè)六重體，并且五個(gè)未配對(duì)的電子定位在鐵的中心上。隨后，在與水分子反應(yīng)時(shí)，F(xiàn)ER-1被質(zhì)子化，形成五配位配合物(圖7B)。Gibbs自由反應(yīng)能表示在苯和水中計(jì)算的驅(qū)動(dòng)HAT從FER-1進(jìn)行自由基還原的整個(gè)過程的熱力，以分別模擬非極性和極性環(huán)境，分別為48.3和10.9kcal mol-1(指CH3OO·自由基)和28.3和-9.1 kcal mol-1(指CH3O·自由基)。這表示FER-1的清除能力及其對(duì)烷氧基而不是氫過氧自由基的偏好(圖7C)。
圖七：在M06-L/6-31G(d，p)，LanL2DZ理論水平上，對(duì)鐵抑素-1鐵配合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面優(yōu)化。Fer-1/FeII(A)和Fer-1/FeIII(B)復(fù)合物分別示于(A)和(B)中。在(C)中，描繪了FER-1清除脂質(zhì)烷氧基自由基(PLO·)和亞鐵還原減少fer-1自由基的示意圖。
六. Ferrostatin-1減少細(xì)胞中不穩(wěn)定的鐵庫
基于細(xì)胞化學(xué)鈣黃綠素-AM(鈣黃綠素-乙酰氧基甲酯)法測(cè)定細(xì)胞“不穩(wěn)定鐵池”(LIP)的尺寸。以DMSO為對(duì)照，增加fe -1的濃度以加入測(cè)定。為了證明該程序的有效性，以100μM deferasirox作為陽性對(duì)照。與完全消除細(xì)胞LIP的鐵螯合劑不同，20μM Fer-1有效地降低不穩(wěn)定的鐵庫濃度不超過50%(圖8)。這一結(jié)果，連同通過DVP和DFT獲得的證據(jù)，支持了Fer-1可以與至少部分細(xì)胞LIP相互作用的觀點(diǎn)。這進(jìn)一步證實(shí)了Fer-1與鐵形成絡(luò)合物的結(jié)論，并間接支持了Fe2+還原FER-1自由基的理論機(jī)制證據(jù)。
圖八：Fer-1結(jié)合不穩(wěn)定鐵池(LIP)的鐵。對(duì)于對(duì)照組，處理細(xì)胞的相對(duì)LIP表達(dá)為鈣黃綠素平均熒光強(qiáng)度(MFI)。以Deferasirox 100μM孵育的細(xì)胞為基線。數(shù)值為2個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，一式三份。