CircRNA-ZBTB44與脈絡(luò)膜新生血管的形成

   脈絡(luò)膜新生血管（CNV）是嚴(yán)重視力喪失的主要原因，在許多眼部疾病中都有發(fā)生，尤其是新生血管年齡相關(guān)性黃斑變性（nAMD）。環(huán)狀RNAs（circRNAs）是一類新的內(nèi)源性非編碼RNA，參與了糖尿病和癌癥內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的調(diào)節(jié)。今天小編帶大家了解最新發(fā)表于雜志“Theranostics”上的文章“Circular RNA-ZBTB44 regulates the development of choroidal neovascularization”。本研究旨在探討circRNA-ZBTB44（cZBTB44）在CNV發(fā)病中的作用。

    在本研究中，我們采用定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測CNV發(fā)生過程中cZBTB44的表達(dá)。采用體外分離蛋白B4染色、HE染色和脈絡(luò)膜發(fā)芽試驗(yàn)，探討cZBTB44在CNV發(fā)生發(fā)展中的作用。另外，通過體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管實(shí)驗(yàn)，探討cZBTB44在血管生成中的作用。通過生物信息學(xué)分析、RNA免疫沉淀分析、熒光素酶分析和體外研究，探討cZBTB44介導(dǎo)CNV發(fā)生的機(jī)制。
結(jié)果：
1.cZBTB44在激光誘導(dǎo)CNV損傷和缺氧應(yīng)激內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)
    我們首先通過熒光原位雜交（FISH）和qRT-PCR檢測cZBTB44是否在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（RF/6A）中表達(dá)。結(jié)果表明，cZBTB44主要在RF/6A細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖1A-B）。然后，我們通過用RNase R處理來自RF/6A細(xì)胞的總RNA來評估cZBTB44的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示cZBTB44對RNase R消化具有抗性，而線性ZBTB44的mRNA很容易降解（圖1C）。我們利用激光光凝技術(shù)建立了小鼠CNV模型，并測定了cZBTB44在激光誘導(dǎo)的體內(nèi)CNV膜中的表達(dá)是否發(fā)生了改變。qRT-PCR檢測顯示，CNV病變中cZBTB44的表達(dá)明顯高于對照脈絡(luò)膜（圖1D）。缺氧被認(rèn)為是CNV形成的重要驅(qū)動因素。將RF/6A細(xì)胞置于含CoCl2的培養(yǎng)基中模擬缺氧條件。我們觀察到，CoCl2治療導(dǎo)致cZBTB44表達(dá)以時間依賴的方式增加（圖1E）。

2.cZBTB44調(diào)節(jié)CNV在體內(nèi)的發(fā)育
    我們設(shè)計(jì)了三種不同的短發(fā)夾RNA（shRNAs）來沉默cZBTB44的表達(dá)。兩種shRNA可顯著降低小鼠脈絡(luò)膜cZBTB44的表達(dá)（圖2A）。我們選擇shRNA2是因?yàn)樗哂懈叩南曅?。為探討cZBTB44在激光誘導(dǎo)CNV中的作用，采用玻璃體腔注射cZBTB44-shRNA2。用免疫熒光法檢測脈絡(luò)膜平坦區(qū)新生血管面積。結(jié)果表明，cZBTB44沉默導(dǎo)致激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型CNV損傷面積減少，與貝伐單抗、阿非貝西普等抗VEGF藥物對CNV的抑制作用相似。此外，cZBTB44沉默聯(lián)合抗血管內(nèi)皮生長因子藥物比其單獨(dú)作用更有效地抑制CNV的形成（圖2B-C）。同樣，HE染色分析顯示cZBTB44沉默導(dǎo)致CNV病變長度和面積減少（圖2D-F）。這些結(jié)果表明cZBTB44參與了CNV的體內(nèi)形成。

3.cZBTB44在體外調(diào)節(jié)CNV的發(fā)育
    我們利用體外模型進(jìn)一步研究了cZBTB44在脈絡(luò)膜血管生成活性中的作用。實(shí)驗(yàn)分為4組：cZBTB44沉默組、cZBTB44高表達(dá)組、shRNA干擾組和未處理組。在第1天、第3天和第5天，對這些外植體的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管發(fā)芽區(qū)域進(jìn)行了拍照。cZBTB44沉默導(dǎo)致發(fā)芽面積減少（圖3A-I）。相比之下，cZBTB44的過表達(dá)導(dǎo)致了更大的血管萌生區(qū)域（圖3J-L）。脈絡(luò)膜萌動區(qū)的定量結(jié)果如圖3所示?？傊?，上述結(jié)果表明cZBTB44參與了體外模型中CNV的調(diào)節(jié)。

4.cZBTB44在體外調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能
    內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是眼部新生血管疾病的主要參與者。因此，我們研究了cZBTB44在體外內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。我們設(shè)計(jì)了三種不同的siRNAs用于cZBTB44沉默。siRNA1和siRNA3轉(zhuǎn)染均能顯著降低cZBTB44的表達(dá)（圖4A）。在基礎(chǔ)條件和缺氧條件下，我們檢測了cZBTB44沉默對RF/6A細(xì)胞功能的影響。siRNA3沉默cZBTB44導(dǎo)致細(xì)胞活力降低（圖4B），增殖減少（圖4C），細(xì)胞遷移和試管形成減慢（圖4D-E）。

5.cZBTB44作為miRNA海綿調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能
    cZBTB44主要表達(dá)于RF/6A細(xì)胞的胞漿中。我們推測cZBTB44可能通過充當(dāng)miRNA海綿來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。環(huán)狀RNA相互作用體數(shù)據(jù)庫和序列分析表明，cZBTB44中miR-578有兩個潛在的結(jié)合位點(diǎn)（圖5A-B）。成熟miRNA的功能鏈被Ago2組裝成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物RISC，從而引導(dǎo)RISC沉默靶mRNA。我們采用RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，與對照組相比，cZBTB44富含含Ago2的免疫沉淀，即免疫球蛋白G（IgG）免疫沉淀（圖5C）。miR-578在含ago2的免疫沉淀物中的表達(dá)水平明顯高于IgG免疫沉淀物(圖5C)。這些結(jié)果也提示cZBTB44和miR-578主要定位于RF/6A細(xì)胞的胞漿中。RNA-FISH也證實(shí)了cZBTB44和miR-578之間的共同定位（圖5D）。接下來我們將cZBTB44序列插入熒光素酶報(bào)告子（LUC-cZBTB44）的下游。miR-578模擬轉(zhuǎn)染降低了LUC-cZBTB44的熒光素酶活性，但對LUC-cZBTB44突變體的熒光素酶活性沒有影響（圖5E）。miR-578模擬轉(zhuǎn)染不影響cZBTB44和ZBTB44 mRNA的表達(dá)水平（圖5F），表明miR-578對cZBTB44和ZBTB44 mRNA的降解沒有影響。使用生物素偶聯(lián)的miR-578，我們觀察到與陰性對照組（生物素化miR-335）相比，miR-578捕獲組分中cZBTB44的富集程度更高（圖5G）。我們還觀察到，與陰性對照組（生物素化cZNF532）相比，cZBTB44捕獲組分中miR-578的富集程度更高（圖5H）。上述結(jié)果提示cZBTB44可作為miR-578在內(nèi)皮細(xì)胞中的海綿。

6.cZBTB44/miR-578相互作用參與內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)
    由于miR-578被cZBTB44誘導(dǎo)，我們研究了miR-578在調(diào)節(jié)RF/6A細(xì)胞功能中的作用。miR-578模擬轉(zhuǎn)染降低了RF/6A細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力，而cZBTB44過表達(dá)可以挽救miR-578模擬轉(zhuǎn)染對RF/6A細(xì)胞功能的影響（圖6A-G）。結(jié)果提示，cZBTB44/miR-578的相互作用參與了內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控。

7.cZBTB44/miR-578相互作用參與CNV的發(fā)育調(diào)控
    我們研究了miR-578在CNV發(fā)生發(fā)展中的作用。agomir注射上調(diào)miR-578可能模擬cZBTB44沉默對CNV形成的影響，顯示出明顯的體內(nèi)外抗血管生成活性（圖7A-D）。我們進(jìn)一步探討了外源cZBTB44的加入是否能抑制miR-578的抑制作用。結(jié)果表明，外源cZBTB44可以阻斷miR-578在CNV中的調(diào)節(jié)（圖7A-D）。因此，我們認(rèn)為cZBTB44/miR-578相互作用參與了CNV的發(fā)育調(diào)控。

8.cZBTB44-miR-578-VEGFA/VCAM1網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮血管生成作用
    我們利用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-578的靶基因。miR-578模擬轉(zhuǎn)染顯著抑制了RF/6A細(xì)胞中VEGFA和VCAM1的表達(dá)（圖8A）。隨后，用熒光素酶報(bào)告法驗(yàn)證miR-578對其血管生成靶點(diǎn)的直接調(diào)控。miR-578模擬轉(zhuǎn)染降低了含有VEGFA和VCAM1靶序列的報(bào)告構(gòu)建物的熒光素酶活性（圖8B）。這些結(jié)果表明miR-578是VEGFA和VCAM1在RF/6A細(xì)胞中的直接調(diào)節(jié)因子。我們還發(fā)現(xiàn)cZBTB44沉默顯著降低了VEGF和VCAM1的表達(dá)（圖8C）。進(jìn)一步的功能分析顯示，VEGFA和VCAM1的過度表達(dá)可以部分緩解cZBTB44沉默對RF/6A細(xì)胞增殖、遷移和管形成的抑制作用（圖8D）。在激光誘導(dǎo)的CNV中，VEGFA和VCAM1的表達(dá)顯著上調(diào)（圖8E）。cZBTB44沉默顯著降低了VEGFA和VCAM1的表達(dá)（圖8F）。因此我們認(rèn)為cZBTB44-miR-578-VEGFA/VCAM1串?dāng)_參與了內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。

9.cZBTB44在CNV患者中的臨床意義
    我們采用qRT-PCR方法檢測了nAMD患者房水（AH）和血漿中cZBTB44的表達(dá)水平。AH，眼內(nèi)的一種重要體液，被認(rèn)為與許多眼部疾病有關(guān)。眼底照片顯示nAMD患者有灰黃色新形成的脈絡(luò)膜血管，伴有視網(wǎng)膜下出血和視網(wǎng)膜內(nèi)液體（圖9A）。光學(xué)相干斷層血管造影（OCTA）顯示黃斑部有一個異常的新生血管網(wǎng)，主要分布在外視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管（圖9B-C）。nAMD患者的AH中cZBTB44、VEGFA和VCAM1的表達(dá)顯著上調(diào)，而年齡相關(guān)性白內(nèi)障（ARC）和青光眼患者的AH沒有增加（圖9D-F）。總之，這些結(jié)果提示cZBTB44可能參與了新血管性AMD的發(fā)病機(jī)制。

結(jié)論：
    這項(xiàng)研究揭示了cZBTB44在CNV發(fā)展中的作用。cZBTB44沉默抑制CNV在體內(nèi)和體外的發(fā)育，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和試管形成。cZBTB44作為內(nèi)源性miR-578海綿調(diào)節(jié)CNV的發(fā)育。這些結(jié)果將有助于更好地了解CNV的形成，開發(fā)新的cZBTB44靶向治療新生血管引起的眼部疾病。