小小外泌體效應(yīng)大

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2020-06-17
隨著新的治療策略的不斷發(fā)展,基于細(xì)胞療法已成為有前途的選項(xiàng)一些疾病。盡管干細(xì)胞具有有益的作用,但它們的臨床應(yīng)用面臨許多挑戰(zhàn).....

  隨著新的治療策略的不斷發(fā)展,基于細(xì)胞療法已成為有前途的選項(xiàng)一些疾病。盡管干細(xì)胞具有有益的作用,但它們的臨床應(yīng)用面臨許多挑戰(zhàn),包括勞動(dòng)量大,成本高和安全性等問(wèn)題。研究表明,成年干細(xì)胞的再生能力主要是由于它們的旁分泌活性,這種分泌是通過(guò)這些分泌物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。減輕細(xì)胞療法問(wèn)題同時(shí)保留細(xì)胞治療益處的一種可行方法是使用分泌組或條件培養(yǎng)基代替實(shí)際細(xì)胞。肺球細(xì)胞分泌蛋白(LSC-Sec)和外泌體(LSC-Exo)的治療效果優(yōu)于源自間充質(zhì)干細(xì)胞的同類藥物。


技術(shù)路線:


結(jié)果:
1. 細(xì)胞分泌蛋白可減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的纖維化和細(xì)胞凋亡

   為檢測(cè)LSC-Sec對(duì)肺修復(fù)和纖維化的影響,使用大劑量博來(lái)霉素建立肺纖維化(PF)模型,炎癥在注射后第7天達(dá)到峰值,并在第9天左右轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維化階段,在炎癥階段結(jié)束后的第十天開始干預(yù),以確保處于疾病模型的治療階段。霧化處理后發(fā)現(xiàn)所有組均顯示出血性壞死,LSC-SecMSC-Sec治療后出血壞死減少。由于Bleo會(huì)誘導(dǎo)DNA損傷,因此我們研究了分泌物治療對(duì)凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)LSC-Sec處理導(dǎo)致肺部細(xì)胞凋亡減少。LSC-SecMSC-Sec都通過(guò)保留肺泡上皮結(jié)構(gòu)和減少膠原蛋白沉積來(lái)減少纖維化,只有LSC-Sec能減少纖維化區(qū)域并使肺泡上皮損傷恢復(fù)至對(duì)照水平。


2. 吸入分泌蛋白可促進(jìn)血管和肺泡修復(fù)
    肺泡上皮由AT1AT2細(xì)胞組成以防御損傷和維持體內(nèi)平衡。AT1標(biāo)記AQP5的免疫染色顯示LSC-Sec處理能夠逆轉(zhuǎn)由Bleo引起的上皮損傷,LSC-Sec處理組中AQP5蛋白增加,表面活性蛋白CProSPC +)陽(yáng)性AT2細(xì)胞的增殖增加。這種反應(yīng)在MSC-Sec處理組中仍然發(fā)生,但程度較低,與PBS組無(wú)顯著差異。只有LSC-Sec處理能夠增加PF肺中vWF +脈管系統(tǒng)的表達(dá)。LSC分泌組顯示出αSMA下降趨勢(shì),MMP2的表達(dá)呈增加趨勢(shì),促炎因子IL-4表達(dá)呈下降趨勢(shì)。


3. LSC分泌蛋白治療二氧化硅引起的肺纖維化
    為檢驗(yàn)LSC-Sec的作用是否可應(yīng)用于其他肺損傷模型,我們使用公認(rèn)的二氧化硅誘發(fā)肺纖維化模型,二氧化硅滴注后第28天開始治療。任何治療組中凋亡細(xì)胞均無(wú)差異,LSC-Sec能顯著降低纖維化的嚴(yán)重程度,二氧化硅誘導(dǎo)的結(jié)節(jié)周圍的纖維化組織強(qiáng)度較小且分布較少,但均持續(xù)存在;還減少了膠原蛋白沉積并減少肺泡上皮損傷。所有組中,兩種肺泡細(xì)胞標(biāo)記物均無(wú)明顯下降,但LSC-Sec能通過(guò)促進(jìn)ProSPC + AT2細(xì)胞表達(dá)并維持AQP5 + AT1細(xì)胞群體來(lái)減少肺泡上皮損傷。


4.LSC-分泌蛋白和外泌體的蛋白質(zhì)組成
    我們使用來(lái)自三個(gè)不同供體LSC的集合分泌蛋白,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢查其蛋白質(zhì)組,并將其與報(bào)道的干細(xì)胞分泌物組進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)在共有的蛋白質(zhì)中,有29.6%的注釋為具有已知分泌膜受體的細(xì)胞外蛋白,而47.5%的注釋為具有未知分泌途徑的胞質(zhì)蛋白,且發(fā)現(xiàn)在LSC-Sec75%的細(xì)胞質(zhì)蛋白是通過(guò)目前未知的機(jī)制或途徑從細(xì)胞釋放的蛋白。
當(dāng)LSC裂解時(shí),大多數(shù)蛋白質(zhì)組由細(xì)胞質(zhì)蛋白(65%)和僅5%的細(xì)胞外蛋白組成。當(dāng)將在LSC-Sec中檢測(cè)到的細(xì)胞質(zhì)蛋白與裂解細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí),我們發(fā)現(xiàn)在分泌組中被分類為細(xì)胞質(zhì)蛋白的222種蛋白中只有56種(25%)來(lái)自潛在的裂解或死細(xì)胞。在三個(gè)供體中鑒定出102種常見細(xì)胞外蛋白中,大多數(shù)是生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白,約一半也在LSC-Exo中鑒定出,許多蛋白都與生物粘附、細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和血小板脫粒有關(guān)。


5. LSC外泌體的治療作用
    檢測(cè)外泌體的功能作用,發(fā)現(xiàn)所有分泌蛋白和外泌體治療組在維持正常肺結(jié)構(gòu),減少纖維化,減少肺細(xì)胞凋亡和膠原沉積 方面均顯示出治療效果。肺αSMA蛋白水平?jīng)]有明顯下降趨勢(shì),LSC-SecLSC-Exo治療可減輕肺泡上皮和血管損傷,并減少纖維化反應(yīng)。

 
6. 外泌體治療改善肺功能和外泌體miRNA分析
    在進(jìn)行吸入博來(lái)霉素的同時(shí)進(jìn)行了多項(xiàng)肺功能測(cè)試,發(fā)現(xiàn)吸氣量、阻力、順應(yīng)性、滯后面積以及強(qiáng)制呼氣量與強(qiáng)制肺活量的比率均呈下降趨勢(shì)。表明所有動(dòng)物的肺功能持續(xù)受損,造成肺損傷,導(dǎo)致組織硬度和彈性反沖增加。通過(guò)分泌蛋白和外泌體治療僅部分恢復(fù)肺功能。LSC-Sec、LSC-ExoMSC-Exo治療后,吸氣能力和呼吸順應(yīng)性均顯著改善,僅使用LSC-Exo治療,呼吸阻力才明顯恢復(fù),而滯后面積和FEV / FVC比均無(wú)明顯變化。
LSC-ExoMSC-Exo的進(jìn)行小RNA測(cè)序分析其miRNA組成差異,發(fā)現(xiàn)有600多個(gè)獨(dú)特miRNA,總共有42個(gè)miRNA在這兩個(gè)外泌體之間差異表達(dá),在LSC-Exo中最上調(diào)的miRNA中有hsa-miR-99a-5phsa-miR-100-5p,并且是miR-99家族成員??估w維化的miR-30a-3p也明顯上調(diào)。